III. Projekty badawcze (granty)

Omówienie wyników podano wg kolejności alfabetycznej autorów.

2.     Projekt badawczy nr 4 P05B 003 16 (1.03.1999-27.02.2002)
Właściwości chemiczne oraz aktywność biologiczna in vitro i in vivo koniugatów fibrynogenu z lekami przeciwnowotworowymi
Kierownik projektu badawczego: dr inż. Janusz Boratyński
Laboratorium Immunologii Nowotworów

          Pomysł zastosowania fibrynogenu jako nośnika leków przeciwnowotworowych jest oparty na znanej jego właściwości kumulowania się w tkankach nowotworowych. Fibrynogen i fibryna są składnikami macierzy spontanicznych i przeszczepialnych nowotworów. Kumulowanie się fibrynogenu/fibryny następuje w wyniku różnych procesów biochemicznych i fizycznych.

          Otrzymane koniugaty fibrynogen-metotreksat wykorzystano u myszy w terapii białaczki P-388. Wykazano korzystniejsze działanie koniugatu w porównaniu z wol­nym lekiem. Jednak w wysokich dawkach koniugatu (powyżej 30 mg leku/kg m.c.) ujawniło się toksyczne działanie preparatu. Wykazano, iż koniugaty są zanieczysz­czone wysokocząsteczkowymi formami leku. Wyizolowano i zbadano właściwości chemiczne i biologiczne polimerów. Polimery nie były odpowiedzialne za toksyczność koniugatów. Stwierdzono, że za toksyczność preparatów odpowiedzialne są koniugaty charakteryzujące się wysokim stopniem podstawienia białka lekiem. Preparaty zawierające 12 moli leku w cząsteczce fibrynogenu charakteryzowała niezwykła właściwość. Rozpuszczały się one w 70% acetonie. Powinowactwo do rozpusz­czalnika organicznego może tłumaczyć toksyczność, będącą następstwem oddziały­wań koniugatów z membranami, lipidami i innymi układami hydrofobowymi.

3.     Projekt badawczy nr 4 P05E 061 11 (01.08.1996- 31.07.1999)
Podwójne wirusowe infekcje jako czynniki ryzyka w transłożyskowych zakażeniach płodu i dysfunkcji śródbłonka
Kierownik projektu badawczego: prof. dr hab. Zofia Błach-Olszewska
Laboratorium Wirusologii

          Z obserwacji klinicznych wiadomo, że równoczesne zakażenia bakteryjne i wirusowe przenoszone na drodze płciowej zwiększają znacznie ryzyko transmisji wirusa niedoboru odporności HIV od matki do dziecka. Dlaczego tak się dzieje nie wiadomo. Badania nasze dotyczyły wyjaśnienia tego zjawiska. Wykazaliśmy, że krętki blade rozbite ultradźwiękami, a także lipopolisacharyd (LPS) E. coli dodane w odpo­wiedniej koncentracji do hodowli skrawków ludzkich łożysk lub błon owodniowych powodują albo zahamowanie replikacji wirusa zapalenia jamy ustnej bydła VSV, lub też stymulację wirusowej replikacji. Efekt zależał od stopnia wrodzonej przeciw­wirusowej odporności. W hodowlach wrażliwych na wirusa, produkty bakteryjne powodowały hamowanie replikacji, w hodowlach o dużym stopniu oporności na wirusa występowała stymulacja namnażania wirusa. Podobne efekty występowały także w zakażeniu dwoma niespokrewnionymi wirusami: VSV i EMCV. Przy użyciu swoistych przeciwciał anty-TNFa wykazaliśmy, że zarówno w efekcie stymulacji jak i hamowania wirusowej replikacji bierze udział endogenny TNFa. Brak jest natomiast korelacji z ilością wytwarzanego TNF.

4.     Projekt badawczy nr 6P04A 022 09 (1.10.1995-1.10.1999)
Badanie zróżnicowania i restrykcji odpowiedzi immunologicznej przeciw antygenom glikopeptydowym
Kierownik projektu badawczego: dr Marcin Czerwiński
Laboratorium Immunochemii Glikokoniugatów

          Badania wykonano na modelu mysiego przeciwciała monoklonalnego N92, rozpoznającego glikozylowaną determinantę grupową N glikoforyny A erytrocytów ludzkich. Fragmenty Fab otrzymane z biblioteki lekkich łańcuchów łączących się z ciężkim łańcuchem N92 poddano dokładnej analizie. Wykazano, że ich stała powino­wactwa wynosi 2.3x10⁷±0.4x10⁷ M.^-1 i jest taka sama dla dwuwartościowego przeciw­ciała monoklonalnego N92 i jednowartościowych fragmentów Fab trzymanych z biblioteki. Natomiast stała powinowactwa fragmentu Fab N92, otrzymanego z zastoso­waniem cDNA kodującego przeciwciało N92, wynosi 3x10⁵±1x10⁵, jest więc około 75 razy niższa; można zatem wnioskować, że stosunkowo wysoka aktywność frag­mentów Fab otrzymanych z biblioteki jest spowodowana przez różnice w sekwencji aminokwasowej między lekkim łańcuchem przeciwciała N92 i lekkimi łańcuchami otrzymanymi z bibliotek (różnic w sekwencji aminokwasowej jest 8, z czego 4 w regionie CDR3). Występują również pewne różnice we właściwościach immuno­chemicznych: fragmenty Fab otrzymane z bibliotek mają szersze optimum pH i są mniej zależne od obecności kwasu sjalowego w epitopie.

          Rekombinowany fragment Fab otrzymany z przeciwciała N92 nie aglutynuje erytrocytów NN nawet w stężeniu 5000 nM (aglutynacja pośrednia z zastosowaniem przeciwciała anty-mysie Fab). Natomiast fragmenty Fab otrzymane z bibliotek aglutynują erytrocyty NN już w stężeniu 1.7 nM (podobnie jak przeciwciało N92), co potwierdza tezę o wzroście powinowactwa w wyniku zmiany lekkich łańcuchów.

          Aby odpowiedzieć na pytanie, czy rekombinowane fragmenty Fab mogą znaleźć zastosowanie w rutynowych analizach serologicznych, zastosowano je do oznaczania grupy N w erytrocytach metodą aglutynacji pośredniej. Wyniki otrzymane z zastosowaniem tych fragmentów oraz klasycznych odczynników serologicznych były takie same; rekombinowane fragmenty Fab otrzymane w wyniku zamiany lekkich łańcuchów mogą więc stanowić alternatywny odczynnik w rutynowych testach sero­logicznych, a ich dodatkową zaletą jest niski koszt i względna łatwość produkcji (możliwe jest otrzymanie ok. 1 mg fragmentów Fab z 1 litra pożywki, co odpowiada 1,3 litra odczynnika stosowanego w teście aglutynacyjnym).

          Aby odpowiedzieć na pytanie, które z podstawień reszt aminokwasowych obserwowanych w lekkich łańcuchach fragmentów Fab otrzymanych z biblioteki są odpowiedzialne za 75-krotny wzrost powinowactwa wobec antygenu, przeprowadzono mutacje punktowe lekkiego łańcucha fragmentu Fab N92 w obrębie CDR3. Reszty aminokwasowe w pozycjach 89, 91, 92 i 96 zmieniono na takie, które są obecne w lekkim łańcuchu fragmentu Fab NNA7, otrzymanym z biblioteki. Stwierdzono, że jedynie zamiana seryny w pozycji 91 na glicynę powodowała podwyższenie powino­wactwa, z tym, że powinowactwo tak skonstruowanego fragmentu Fab jest około 50 razy niższe niż powinowactwo fragmentu Fab NNA7. Prawdopodobnie za podwyż­szenie powinowactwa fragmentu Fab NNA7 jest więc odpowiedzialna więcej niż jed­na zamiana reszt aminokwasowych. Prace nad tym tematem są obecnie kontynuowane.

Publikacja nr 6

5.     Projekt badawczy nr 6 P04A 015 12 (01.03.1997-28.02.2001
Wpływ struktury łańcucha polipeptydowego na biosyntezę łańcuchów polilaktozaminowych, badany na modelu rekombinacyjnej glikoforyny C ludzkich erytrocytów
Kierownik projektu badawczego: dr Ewa Jaśkiewicz
Laboratorium Immunochemii Glikokoniugatów

          W roku sprawozdawczym przygotowywano materiał do analizy struktury N-glikozydowych łańcuchów cukrowych rekombinacyjnych form glikoforyny C (GPC). Z uwagi na bardzo niski poziom ekspresji GPC w komórkach CHO, wykorzys­tano system przejściowej ekspresji w komórkach COS7, co pozwoliło znacznie zwięk­szyć ekspresję GPC. Rekombinacyjne formy GPC zawierające sekwencję (His)6 na C-końcu łańcucha polipeptydowego, oczyszczano przez chromatografię powino­wactwa na (Ni²⁺) Agarozie. Otrzymano frakcje wzbogacone w GPC lecz zawierające jeszcze szereg dodatkowych białek. Frakcje te wymagają dalszego oczyszczania przed zastosowaniem metody metabolicznego piętnowania cukrów.

6.     Projekt badawczy nr 4 P05A 082 14 (1.04.1998-31.03.2001)
Białka sygnałowe fotoreceptorów jako antygeny w retinopatiach paranowotworowych, chorobach neurodegeneracyjnych i procesach zapalnych błony naczyniowej i siatkówki
Kierownik projektu badawczego: doc. dr hab. Wojciech Gorczyca
Laboratorium Białek Sygnałowych

          Celem realizowanego projektu jest stwierdzenie czy niektóre zaburzenia funkcji siatkówki i w konsekwencji widzenia wiążą się z występowaniem w surowicach chorych przeciwciał przeciwko określonym białkom siatkówki. Przedmiotem naszego zainteresowania są białka biorące udział w procesie zamiany sygnału świetlnego na sygnał nerwowy (proces fototransdukcji) w fotoreceptorowych komórkach siatkówki. Badania przeprowadzone w roku 1999 realizowano zgodnie z planem. Opracowano i wdrożono metody detekcji w surowicach chorych przeciwciał przeciwko kolejnym wybranym antygenom siatkówkowym (kinaza rodopsynowa, fosducyna, białka S100). Stwierdzono, że antygenem siatkówki najczęściej rozpoznawanym przez przeciwciała obecne w badanych surowicach jest białko o ciężarze cząsteczkowym  43-45 kDa. Podjęto badania mające na celu zidentyfikowanie tego białka. Część surowic roz­poznawała również antygen o ciężarze około 48 kDa zidentyfikowany jako arestyna.

7.     Projekt badawczy  nr 6 P04B 025 16 (1.05.1999-30.04.2002)
Organizacja i ekspresja zespołu genów nowej syntazy poliketydowej typu I Streptomyces coelicolor A3(2) jako wstęp do biosyntezy nowych leków
Kierownik projektu badawczego: dr Katarzyna Kuczek
Laboratorium Biologii Molekularnej Mikroorganizmów

          Celem prowadzonych badań jest poznanie sekwencji nukleotydowej domen oraz organizacji molekularnej modułów nowej syntazy poliketydowej kodowanej przez genomowy DNA promieniowca Streptomyces coelicolor A3(2). Badane geny posłużą do konstrukcji plazmidów przeznaczonych do rekombinacji z genami innych syntaz poliketydowych typu I.

          W toku realizacji badań wykonano następujące prace:

- oznaczono sekwencję nukleotydową przypuszczalnych domen: acylotransferazowej i ketosyntazowej należących do jednego modułu syntazy. W obrębie tego samego modułu oznaczono również częściową sekwencję domeny dehydratazowej i keto­reduktazowej;

- oznaczono sekwencję nukleotydową odrębnego genu kodującego przypuszczalną tioesterazę. Obecnie gen tioesterazy jest klonowany w wektorze ekspresyjnym, który umożliwi wprowadzenie tego genu do genomowego DNA promieniowca;

- ustalono lokalizację dwóch modułów badanej syntazy na chromosomie S. coelicolor A3(2) i ustalono, że wchodzą one w skład osobnych genów. Ustalono ponadto, że jeden z genów syntazy znajduje się w sąsiedztwie opisanego przez inne laboratorium genu karboksylazy propionylo-CoA.

Wyniki badań były prezentowane w formie komunikatów na I Krajowym Kongresie Biotechnologii we Wrocławiu i na 11^th International Symposium on the Biology of Actinomycetes na Krecie.

8.     Grant  nr 6 P04A 006 15 (1.10.1998-30.09.2001)
Białko DnaA ze Streptomyces lividans inicjator replikacji liniowego chromosomu
i czynnik transkrypcyjny
Kierownik projektu badawczego: doc. dr Jolanta Zakrzewska-Czerwińska
Laboratorium Biologii Molekularnej Mikroorganizmów

          Scharakteryzowano oddziaływanie inicjatorowego białka DnaA z 9-merowymi sekwencjami DnaA (boksami DnaA) regionu oriC oraz regionu promotorowego genu dnaA. Wyznaczono stałe kinetyczne wiązania białka DnaA z DNA. Pojedynczy boks DnaA wiązany jest z niskim powinowactwem przez białko DnaA. Do efektywnego związania się białka DnaA niezbędna jest obecność co najmniej dwóch boksów DnaA. Stwierdzono, że białko DnaA wiąże się kooperatywnie do dwóch boksów DnaA. Określony układ przestrzenny rozpoznawanych sekwencji (typu głowa-głowa) umoż­liwia oddziaływanie cząsteczki białka związanej do jednego boksu z cząsteczką białka wiążącą się do sąsiedniego boksu. Dwie niezależnie dimeryzujące domeny I i III uczestniczą w oddziaływaniach międzycząsteczkowych białka DnaA. Białko DnaA ze Streptomyces jest pierwszym białkiem inicjującym replikację chromosomu, dla którego stwierdzono udział dwóch niezależnych domen w dimeryzacji.

Publikacje nr: 42, 46, 114

9.     Projekt badawczy nr 4 P05B 097 16 (1.01.1999-31.12.2001)
Wykorzystanie przeciwprądowego wirowania z elutriacją (CCE) dla optymalnego przygotowania preparatów PBPC w przeszczepach allogenicznych u człowieka
Kierownik projektu badawczego: prof. dr Andrzej Lange
Laboratorium Immunologii Klinicznej

          Przeciwprądowe wirowanie z elutriacją (CCE) wykorzystywane jest w celu usunięcia z materiału przeszczepowego (PBPC) limfocytów T (CD3+) odpowie­dzialnych za inicjację choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD), stano­wiącej istotne powikłanie po przeszczepach komórek hematopoetycznych. Ryzyko wystąpienia GvHD jest wyższe gdy nie ma całkowitej zgodności pomiędzy dawcą i biorcą przeszczepu. Dlatego też w przypadku allogenicznych przeszczepów alterna­tywnych (haplotypowo zgodnych) często, w celu zmniejszenia ryzyka GvHD, stosuje się materiał przeszczepowy z usuniętymi limfocytami T, przy czym istotne jest zachowanie niewielkiej liczby tych komórek (min. 5 x 10⁵ /kg biorcy) gdyż obecność ich warunkuje przyjęcie się przeszczepu. Metoda CCE pozwala na zachowanie w materiale przeszczepowym odpowiedniej, do uzyskania trwałej odnowy hemato­logicznej, liczby komórek progenitorowych (CD34+).

          Wykorzystując metodę CCE wykonaliśmy 7 przeszczepów alternatywnych od dawców rodzinnych u 6 pacjentów. Dwoje chorych (dziecko i dorosły) cierpiało na nowotwory układu krwiotwórczego a czworo dzieci na wrodzone niedobory odpor­ności. W przypadku jednego dziecka wykonano transplantację dwukrotnie z powodu nie przyjęcia się pierwszego przeszczepu. Przeciwprądowemu wirowaniu z elutriacją poddawano preparaty PBPC pobrane od zdrowych dawców, po wcześniejszej mobili­zacji komórek hematopoetycznych do krwioobiegu za pomocą czynnika wzrostowego granulocytów (G-CSF). Stosowano dwa protokoły elutriacyjne. Według pierwszego protokołu (6 elutriacji u dzieci) zbierano 5 frakcji elutriacyjnych przy przepływach medium wymywającego 70, 110, 140 i 170 ml/min i przy „wyłączonym rotorze”. Drugi protokół zastosowano u pacjenta dorosłego i zbierano frakcje: 50, 90, 110, 140 ml/min i „wyłączony rotor”. W przypadku przeszczepów u dzieci jednorazowa elutriacja wystarczała do zebrania odpowiedniej liczby komórek CD34+/kg biorcy. U pacjenta dorosłego wykonano osiem elutriacji z trzech preparatów PBPC. Wszystkie wyjściowe preparaty PBPC oraz otrzymane frakcje elutriacyjne opisano fenotypowo (metody cytometrii przepływowej), pod kątem zawartości komórek CD3+, CD14+ (monocyty) i CD34+. Barwienie na obecność komórek CD34+ wykonano w układzie podwójnej fluorescencji, równocześnie z barwieniem przeciwciałem anty-HLADR. Umożliwiło to określenie odsetka komórek CD34+HLADR+ (późne, ukierunkowane progenitory odpowiedzialne za pierwszą falę odnowy hematologicznej) oraz komórek CD34+HLADR- (komórki progenitorowe nieukierunkowane odpowiedzialne za trwałą odnowę hematologiczną). Wyjściowe preparaty PBPC zawierały średnio 30.1%±3.4 komórek CD3, 39.1%±4.4 CD14 oraz 0.81%±0.11 CD34 (w tym 0.71%±0.09 CD34+HLADR+ i 0.10%±0.02 CD34+HLADR-). Frakcje elutriacyjne, które nie zostały zakwalifikowane do przeszczepiania (70 ml/min i 110 ml/min) zawierały 68.6%±2.8 komórek CD3+, 4.7%±1.0 CD14+ i 0.30%±0.07 CD34+ (0.21%±0.05 CD34+HLADR+ i 0.09%±0.02 CD34+HLADR-). Jako materiał transplantacyjny kwalifikowano frakcje pozbawione limfocytów CD3+, wzbogacone w monocyty i niezubożone w komórki progenitorowe. W przypadku zastosowania pierwszego protokołu były to frakcje 140 i 170 ml/min, natomiast przy drugim protokole elutriacji frakcja „wyłączony rotor”. Przeszczepione frakcje zawierały odsetkowo średnio 0.9%±0.4 CD3, 70.8%±1.6 CD14 i 1.36%±0.2 CD34+ (1.21±0.2 CD34+HLADR+ i 0.15%±0.04 CD34+HLADR-) co w przeliczeniu dało 1.5(±0.4)x10⁶ komórek CD3+/kg ciężaru ciała biorcy (średnia z 6 przeszczepów wykonanych po raz pierwszy; w przypadku przeszczepu powtórnego przetoczono 25.0 x 10⁶ k-k CD3+/kg c.c.) oraz 3.9 x 10⁶ k-k CD34+/kg .

          U wszystkich chorych doszło do odnowy hematologicznej, ponadto są oni regularnie monitorowani odnośnie odnowy immunologicznej i chimeryzmu poprzesz­czepowego.

          Wyniki badań zostały przedstawione na:

·       2^nd World Congress on Tissue Banking "Towards the Third Millenium", Warszawa,

·       41^th Annual Meeting of American Society of Hematology, New Orleans, USA, -abstrakt opublikowany: w Blood, 1999, vol. 94 (10), suppl. 1 (part 2 of 2) p. 337b.

·       26^th Annual Meeting European Group for Blood and Marrow Transplantation, Innsbruck (Austria).

10. Projekt badawczy nr 6 P04B 013 11 (1.11.1996-31.10.1999)
Synteza i immunotropowe właściwości zmodyfikowanych form nonapeptydu (NP), aktywnego fragmentu immunomodulatorowego polipeptydu bogatego w prolinę (PRP) z siary owiec
Kierownik projektu badawczego: prof. dr Józef Lisowski
Laboratorium Immunochemii Ogólnej

          W 1999 r. prowadzone były badania nad wpływem PRP i NP oraz jego analogów na indukcję sekrecji cytokin (IFNg, TNFa, IL-6 i IL-10) w hodowlach komórek pełnej krwi ludzkiej. Stwierdzono, że zarówno NP jak i jego analogi wykazywały wyraźnie niższą aktywność niż PRP, szczególnie w przypadku indukcji sekrecji interferonu. Na uwagę zasługuje fakt, że zależność indukcji sekrecji badanych cytokin od stężenia PRP charakteryzowana była krzywą dzwonową. Wskazuje to, że PRP posiada nie tylko zdolność do indukcji cytokin, ale również zdolność dwu­kierunkowej regulacji, tj. zarówno indukcji i hamowania sekrecji tych cytokin. Efekt ten może być spowodowany faktem, że PRP jest kompleksem peptydów bogatych w prolinę i jego aktywność biologiczna jest wypadkową aktywności peptydów obecnych w PRP. Regulatorowy wpływ PRP obserwowaliśmy również we wcześniejszych badaniach wpływu tego kompleksu na odpowiedź immunologiczną.

          Badania realizowano we współpracy z prof. drem Gotfrydem Kupryszewskim z Wydziału Chemii Uniwersytetu Gdańskiego. Uzyskane wyniki prezentowane były na Konferencji Biologii Komórki w Krakowie i są przygotowywane do publikacji.

11. Projekt badawczy nr 4 P05B 100 13 (1.07.1997-30.06.2000)
Opis i zastosowanie w autotransplantacji PBPC wzbogaconych w komórki pnia (wirowanie z elutriacją wyjściowego preparatu aferetycznego) układu
limfo-hematopoetycznego u chorych z przewlekłą białaczką szpikową
Kierownik projektu badawczego: dr Anna Łaba
Laboratorium Immunologii Klinicznej

12.  

          Postępowaniem transplantacyjnym w leczeniu przewlekłej białaczki szpikowej (CML) jest zastosowanie agresywnej chemioterapii z autoprzeszczepem. W przebiegu CML dochodzi do współzawodnictwa pomiędzy klonami bcr(-)abl(-) i bcr(-)abl(+) z przewagą tych ostatnich w puli komórek CD34. Metodą, która różnicuje komórki macierzyste układu krwiotwórczego jest metoda przeciwbieżnego wymywania z wiro­waniem (CCE-Counterflow Centrifugal Elutriation).

          Metodę tę wykorzystano do uzyskania materiału transplantacyjnego poprzez rozfrakcjonowanie preparatu komórek jednojądrowych uzyskanych drogą aferezy z krwi obwodowej (PBPC). W ramach realizacji projektu w 1999 wykonano elutrację preparatu PBPC od dwóch pacjentów z przewlekłą białaczką szpikową.

          Zastosowano następujący protokół elutriacji: przy stałej prędkości rotora elutriacyjnego 3000 rpm w temp. 25^oC, wymywano poszczególne frakcje komórkowe zmieniając prędkości wypływu medium na 70 ml/min, 110 ml/min, 140 ml/min, 170 ml/min. oraz frakcję komórek przy zatrzymanym rotorze wirówki.

          Każda z otrzymanych frakcji była charakteryzowana poprzez barwienie przeciwciałami monoklonalnymi i analizowana w cytofluorymetrze (FACS). Analiza fenotypowa poszczególnych frakcji elutriacyjnych pozwoliła na wyodrębnienie frakcji komórek CD34 +. Wykazano obecność komórek pnia CD34+HLA DR, oraz komórek, które nabyły antygeny dojrzałości immunologicznej (CD34+, CD38+, HLA-DR+). Wykazano również obecność komórek z aberacją chromosomową CD34+ bcr(-)abl(+), wykorzystując do tego celu metody biologii molekularnej RT- PCR^-.

13. Grant nr: 6 P04A05114 (1.03.1998-28.02.2000)
Endotoksyny Plesiomonas shigelloides - porównawcze badania strukturalne preparatów izolowanych z serologicznie pokrewnych szczepów
Kierownik projektu badawczego: dr Tomasz Niedziela
Laboratorium Immunochemii Drobnoustrojów i Szczepionek

          W roku 1999 zrealizowano zgodnie z przyjętym harmonogramem następujące zadania badawcze:

- Przygotowano masę bakteryjną wybranych szczepów Plesiomonas shigelloides niezbędną do dalszej szczegółowej analizy strukturalnej. Uzyskane wcześniej dane z wstępnych analiz HR-MAS NMR i badań serologicznych wykorzystano przy wyborze szczepów poddanych badaniom porównawczym oraz szczegółowym badaniom strukturalnym. Otrzymano kilkudziesięciogramowe porcje suchej masy bakteryjnej. Lipopolisacharydy z wybranych szczepów Pl. shigelloides wyizolowano metodą ekstrakcji fenolowo-wodnej i oczyszczono przez ultrawirowanie.

- Przygotowano hydrolizaty LPS - wyizolowano frakcje łańcuchów O-swoistych i oligocukrów rdzeniowych. Frakcje łańcuchów O-swoistych oraz oligocukrów rdzenio­wych LPS otrzymano przez łagodną hydrolizę kwasową i rozdział w filtracji żelowej (BioGel P-2, P-10).

- Wykonano analizę chemiczną otrzymanych preparatów przeprowadzoną ze względu na brak danych dotyczących struktur łańcuchów O-swoistych i oligocukrów rdzenia LPS Pl. shigelloides. Nie znany jest skład cukrowy, typ wiązań i ich anomeria oraz absolutna konfiguracja składników w obrębie heteropolisacharydowej części lipopolisacharydu. Badania prowadzono stosując klasyczne metody chemii cukrów, jak: analiza cukrowa, metylacyjna, swoiste degradacje.

- Otrzymane preparaty (masa bakteryjna, lipopolisacharydy, wyizolowane frakcje łańcuchów O-swoistych i oligocukrów rdzeniowych) są analizowane stosując szereg metod instrumentalnych - techniki NMR, spektrometrii masowej MALDI-TOF i FAB--MSMS. Badania z zastosowaniem spektroskopii NMR oraz spektrometrii masowej (MALDI-TOF, FAB) są prowadzone w ramach współpracy z Instytutem Chemii, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, Szwecja.

14. Projekt badawczy nr 4 PO5A 083 15 (1.10.1998-31.09.2001)
Badania nad rola antygenu karcynoembrionalnego i sjalo Lewis^A w procesie przerzutowania - wykorzystanie strategii antysensownego RNA w badaniach modelowych z zastosowaniem ludzkich komórek raka okrężnicy
Kierownik projektu badawczego: dr Adam Opolski
Laboratorium Immunologii Nowotworów

I.                Otrzymanie wariantowych komórek CX-1.1 z zahamowaną ekspresją antygenu karcynoembrionalnego (CEA)

         W pierwszym etapie badań skonstruowano wektory ekspresyjne, zawierające fragment cDNA dla CEA w orientacji antysensownej wobec promotora. Fragment ten uzyskano w wyniku wycięcia odcinka DNA o długości 872 par zasad z cDNA dla CEA, umieszczonego w wektorze pSG5. Otrzymany fragment wklonowano do wektorów: a) pCDNA3- posiadającego promotor  wirusa CMV i gen oporności na genetycynę oraz b) pHbbApr-1-Neo- posiadający promotor ludzkiej bb-aktyny i gen oporności na genetycynę.

         W drugim etapie badań otrzymanymi wektorami transfekowano, z wykorzys­taniem lipofektyny, jeden z klonów (CX-1.1) linii komórkowej CX-1 ludzkiego raka okrężnicy, charakteryzującego się wysoką ekspresją antygenów CEA i sjalo-Lewis^a. Uzyskano transfektanty komórkowe, wykazujące oporność na genetycynę, które badano pod względem ekspresji CEA metodą cytofluorymetrii przepływowej. W przypadku wektora pCDNA3 z wklonowanym antysensownym fragmentem genu dla CEA nie udało się do tej pory wyodrębnić klonów charakteryzujących się znacznym spadkiem ekspresji CEA na powierzchni komórek. Takie klony otrzymano natomiast w wyniku transfekcji wektorem pHbbApr-1-Neo z wklonowanym w orientacji antysensownej fragmentem genu dla CEA. Jednak szczegółowe określenie stopnia zahamowania ekspresji CEA w uzyskanych komórkach oraz stabilności takich transfektantów wymaga przeprowadzenia dodatkowych eksperymentów.

II.            Otrzymanie wariantowych komórek CX-1.1 z zahamowaną ekspresją zarówno CEA jak i sjalo-Lewis^a

W pierwszym etapie fragment cDNA o długości 872 par zasad, pochodzący z cDNA dla CEA wklonowany w wektor pSG5, umieszczono w wektorze CEP-4 posiadającym promotor CMV oraz gen oporności na higromycynę.

          W drugim etapie, tak skonstruowanym wektorem, transfekowano przy użyciu lipofektyny podlinię komórkową CX-1.1FTIIIAS5 raka okrężnicy, charakteryzującą się całkowitym zahamowaniem ekspresji antygenu sjalo-Lewis^a. Obecnie przepro­wadzane są doświadczenia mające na celu wyodrębnienie klonów, charakteryzujących się obniżoną ekspresją CEA.

15. Projekt badawczy nr 4 P05A 123 14 (1.05.1998-30.04.2001)
Badania nad mechanizmami odpowiedzialnymi za efekt przeciwnowotworowy allogenicznych szczepionek komórkowych zastosowanych w układach modelowych
Kierownik projektu badawczego: dr Elżbieta Pajtasz-Piasecka
Laboratorium Immunologii Nowotworów

Prace przeprowadzone w 1999 r. były kontynuacją badań rozpoczętych w poprzednim okresie sprawozdawczym.

Wykonano serię doświadczeń mających na celu określanie stopnia tumoro­genności pasażowanych in vitro komórek linii mysiego raka okrężnicy MC38. Komórki wszczepiano podskórnie w liczbie 0,375x10⁶ do 4x10⁶ komórek/mysz. Uzyskane wyniki wskazują, że we wszystkich zastosowanych dawkach, komórki te zdolne są do wzrostu po przeszczepieniu do syngenicznych myszy. Ponadto, odnotowano przyśpieszenie wzrostu guzów oraz obniżenie liczby komórek niezbędnej do przyjęcia się przeszczepu. Zaobserwowano różnice wzrostu guzów w myszach C57BL/6 w porównaniu do wzrostu u mieszańców F1 (C57BL/6 x DBA2). Zarówno kinetyka wzrostu nowotworu w obu szczepach jak i liczba przyjętych guzów różniły się w sposób znaczący: w przypadku myszy syngenicznych - 100 procent przyjęć, w przypadku myszy semisyngenicznych - pojedyncze przyjęcia (15%). W związku z obserwowanym zjawiskiem zaplanowano zbadanie antygenów powierzchniowych odpowiedzialnych za zwiększoną immunogenność komórek MC38 w układzie myszy semisyngenicznych.

Kontynuowano również analizę funkcjonalną komórek odpowiedzialnych za wywoływanie odpowiedzi przeciwnowotworowej u myszy B6D2F1 (mieszańce F1) obarczonych podskórnie rosnącym przeszczepem MC38. Celem zaplanowanych doświadczeń było określenie wpływu wielokrotnego, okołoguzowego podania ko­mórek mysiego szpiczaka transfekowanych genem mIL-2 (X63-mIl-2) na wzrost guzów oraz na pobudzanie komórek wartowniczych węzłów chłonnych (LNc).

A) Oznaczano aktywności IL-2 i IFN w nadsączach z 24h hodowli LNc nie stymulowanych Con A lub z jej dodatkiem. W nadsączach z hodowli niestymulo­wanych in vitro, aktywność IL-2 wykazano jedynie w przypadku hodowli LNc uzyskanych od myszy, którym 7 dni wcześniej okołoguzowo podano alloszczepionkę. W żadnej z badanych hodowli nie wykazano aktywności interferonowej. W hodowlach stymulowanych Con A aktywność IL-2 utrzymywała się na wysokim poziomie i nie ulegała istotnym statystycznie wahaniom. Odnotowano natomiast stopniowy wzrost produkcji IFN przez komórki węzłów chłonnych pobieranych od leczonych myszy. Pojawianie się IFN tylko w hodowli stymulowanej Con A sugeruje, że jest to IFN-g produkowany przez komórki limfatyczne.

B) Podjęto badania dotyczące określenia odpowiedzi przeciwnowotworowej w miejscu wzrostu guza. W tym celu nawiązano współpracę z Instytutem Biologii Mole­kularnej im. J. Zurzyckiego U.J. w Krakowie, (z dr Martyną Elas) i wykonano kilka pilotowych doświadczeń, aby ocenić zmiany produkcji NO w tkance nowotworowej pod wpływem zastosowanego leczenia transfekowanymi komórkami X63-IL-2. Początkowo zaobserwowano niewielki wzrost sygnału EPR w stosunku do grupy kontrolnej (guzy pobrane od myszy nieleczonych lub od myszy traktowanych PBS). Począwszy od 3 podania komórek X63-mIL-2, odnotowano stopniowy wzrost pro­dukcji NO w tkance guza MC38.

16. Projekt badawczy nr 4PO5A 006 13 (01.08.1997-31.07.2000)
Badania nad ekspresją proto-onkogenów i białek przekazujących sygnał do apoptozy lub proliferacji w czasie różnicowania się tymocytów w komórkach chłoniaków grasicy myszy z transgenicznym TCR
Kierownik projektu badawczego : doc. dr Leon Strządała
Laboratorium Immunologii Komórkowej

          Zbadano wpływ swoistych inhibitorów kinaz i fosfataz zaangażowanych w szlakach przekazywania sygnału do apoptozy od TCR w komórkach chłoniaków grasiczych. Szlak sygnałowy selekcji pozytywnej prowadzący do aktywacji kinaz MAP hamowano PD98059, inhibitorem kinazy MKK1/2. Szlak selekcji negatywnej hamowano inhibitorami SB203580 i SB202190, odpowiednio p38 i p38, JNK. Szlak wapnio-zależny hamowano KN62, inhibitorem kinaz zależnych od kalmoduliny (CaMK II, IV) i FK506 inhibitorem kalcyneuryny. Kinazy serynowo-treoninowe hamowano inhibitorami HA1004 i H7, natomiast cPKC, PKA oraz PKG, odpowiednio inhibitorami BIM, KT5720 i KT5823. Komórki linii i klonów chłoniaków grasiczych po preinkubacji z badanym inhibitorem traktowano jonomycyną, na którą są oporne (kontrolę stanowiło traktowanie etopozydem, na który są wrażliwe) i mierzono apoptozę. Wrażliwość na apoptozę uzyskano w wyniku hamowania:

·       szlaku selekcji pozytywnej, ale nie negatywnej,

·       w szlaku wapnio-zależnym przez hamowanie kalcyneuryny, ale nie CaMK,

·       wśród kinaz serynowo-treoninowych przez hamowanie aktywności wrażliwej na HA1004 innej niż cPKC, PKA i PKB.

Projekty badawcze promotorskie

17. Projekt badawczy nr 4 P05A 038 10 (01.04.1996-28.02.1999)
Badania nad lipopolisacharydami zawierającymi kwas sjalowy
Kierownik projektu badawczego: doc. dr hab. Andrzej Gamian
Laboratorium Mikrobiologii Lekarskiej

          Projekt dotyczy badań nad strukturą i funkcją kwasu sjalowego w bakteryjnych lipopolisacharydach. Przedmiotem badań są szczepy z rodziny Enterobacteriaceae, które wytwarzają długołańcuchowe polisacharydy O-swoiste z kwasem sjalowym. W zakresie analizy epitopów w tych antygenach przeprowadzono dalsze testy zahamo­wania reakcji serologicznych. Następnie przeprowadzono doświadczenia nad endo­toksyną Hafnia alvei 2, w której zidentyfikowano wcześniej kilka oligosacharydów o nietypowej budowie. Ze względu na kwasolabilność połączeń w tym lipopoli­sacharydzie, zastosowano metodę hydrazynolizy i alkalicznej hydrolizy dla odłączenia wszystkich kwasów tłuszczowych z cząsteczki lipopolisacharydu. Produkty takiej degradacji rozdzielano na kolumnach filtracji żelowej. Tą metodą otrzymano z LPS oligosacharydy, które będą dalej badane metodami spektroskopii NMR. Pozwoli to na ostateczne określenie budowy tej złożonej endotoksyny zawierającej kwas sjalowy.

18. Projekt badawczy nr 4 P05A 088 14 (1.04.1998-31.12.1999)
Badania immunochemiczne nad polisacharydowymi antygenami powierzchniowymi gronkowców koagulazo-ujemnych
w kierunku opracowania szczepionki koniugatowej
Kierownik projektu badawczego: doc. dr hab. Andrzej Gamian
Laboratorium Mikrobiologii Lekarskiej

          Przedmiotem badań objętych niniejszym projektem są szczepy gronkowców koagulazo-ujemnych z rodzaju Staphylococcus, izolowane z materiału klinicznego oraz referencyjny szczep S. epidermidis ATCC 35984. Opracowano postępowanie prowadzące do otrzymania wspólnego antygenu dla wielu gronkowców, będącego homopolimerem glukozaminy. Procedura polega na swoistej degradacji kwasem fluorowodorowym kwasów tejchojowych celem ich usunięcia z mieszaniny wydzie­lonych antygenów powierzchniowych. Obejmuje również użycie nukleaz, pronazy, chromatografii jonowymiennej i filtracji żelowej. Zastosowanie podłoży synte­tycznych do hodowli tych gronkowców pozwoliło zwiększyć wydajność preparacji wspólnego antygenu gronkowcowego.

          Analiza serologiczna z użyciem surowic króliczych skierowanych przeciwko komórkom kilku szczepów S. epidermidis i S. pulvereri pozwoliła na podział kilku­dziesięciu gatunków gronkowców koagulazo-ujemnych na trzy grupy serologiczne. Świadczy to o obecności wspólnych determinant antygenowych u gronkowców.

Projekty badawcze dla młodego pracownika nauki

20. Projekt badawczy nr  4 PO5B 058 15 (01.07.1998-30.06.1999)
Ekspresja antygenu CD28 na subpopulacjach limfocytów krwi obwodowej u pacjentów z ziarnicą złośliwą w różnych fazach choroby
Kierownik projektu badawczego: lek. med. Dorota Boćko
Laboratorium Immunopatologii

          Przeprowadzone badania odporności u chorych na ziarnicę złośliwą wykazały znaczne zaburzenia głównie w zakresie odpowiedzi komórkowej.

          CD28, homodimer powiązany mostkiem dwusiarczkowym podobnie jak i jego ligandy jest przezbłonową glikoproteiną typu I z N-końcem na zewnątrz komórki należącą do nadrodziny immunoglobulin. CD28 pośredniczy w przekazywaniu sygnału przy aktywacji i proliferacji limfocytów T. Zwiększa ekspresję genów wielu cytokin produkowanych przez limfocyty T wpływając stymulująco na szybkość transkrypcji i stabilność odpowiednich mRNA. Stymulacja CD28 zwiększa 5-50 razy wydzielanie IL-2, IL-3, IL-4, TNF alfa, IFN gamma, GM-CSF przez pobudzone limfocyty T.

          Celem badania było określenie ekspresji antygenu CD28 na poszczególnych subpopulacjach limfocytów T krwi obwodowej u chorych na ziarnicę złośliwą w aktywnej fazie choroby w remisji klinicznej w porównaniu z grupą osób zdrowych, co pozwoli na określenie zależności pomiędzy ekspresją tego antygenu w badanych subpopulacjach limfocytów u tych chorych a dalszym rokowaniem przebiegu choroby.

          Badania przeprowadzono u 14 chorych w aktywnej fazie choroby (AFCH) w III  i IV stadium zaawansowania klinicznego, uprzednio nie leczonych, 12 chorych w całkowitej remisji klinicznej (CRK) i u 10 osób zdrowych (ZDR), wiekiem i płcią odpowiadającym badanej grupie chorych.

          Wyniki badań wykazały, znacznie obniżoną ekspresję antygenu CD28 na limfo­cytach CD3(+), CD4(+), CD8(+), zarówno w aktywnej fazie choroby jak również w remisji klinicznej w porównaniu z kontrolną grupą osób zdrowych. Najniższą ekspresję CD28 zanotowano w subpopulacji limfocytów CD8(+) w aktywnej fazie ziarnicy złośliwej - tabela 1.

Tabela 1. Średni odsetek limfocytów T podwójnie pozytywnych pod względem ekspresji antygenu CD28 w obrębie subpopulacji CD3+, CD4+, CD8+ u chorych na ziarnicę złośliwą w aktywnej fazie choroby (I), całkowitej remisji klinicznej (II) i u osób zdrowych (III).

Wyniki badań wskazują, że u chorych na ziarnicę złośliwą limfocyty krwi obwodowej wykazują stałą, utrzymującą się również w stadium remisji klinicznej upośledzoną ekspresję cząsteczki CD28, która odgrywa kluczową rolę we wzmacnianiu sygnału aktywującego, pochodzącego z kompleksu TCR/CD3, co może być jednym z mechanizmów upośledzenia odporności komórkowej w tym schorzeniu. Znaczne upośledzenie ekspresji tej cząsteczki w subpopulacji limfocytów CD8(+) może tłumaczyć utrzymującą się u tych chorych skłonność do zakażeń.

23. Projekt badawczy nr 6 P040A 047 16 (1.03.1999-1.03.2000)
Swoistość serologiczna i aktywność antylipopolisacharydowa przeciwciał skie­rowanych przeciwko oligocukrowi rdzenia endotoksyny Escherichia coli J5
Kierownik projektu badawczego: mgr inż. Jolanta Czaja
Laboratorium Immunochemii Drobnoustrojów i Szczepionek

          Szorstkie mutanty bakterii takie jak Escherichia coli J5 posiadają na swojej powierzchni niepełną strukturę lipopolisacharydu (LPS), która zawiera region rdzeniowy o ograniczonej zmienności w obrębie danego gatunku. W szorstkich mutantach pokładano nadzieje, że posłużą do uzyskania ochronnych surowic o szerokim zakresie działania w przypadkach uogólnionych zakażeń bakteryjnych. Realizując niniejszy projekt otrzymano koniugaty oligocukru rdzenia E. coli J5 z toksoidem tężcowym, a następnie uzyskano królicze surowice odpornościowe skiero­wane przeciwko koniugatowi oraz zabitym komórkom bakteryjnym E. coli J5. Scharakteryzowano otrzymane surowice pod kątem ich właściwości antyendo­toksynowych oraz zakresu swoistości przy użyciu metod immunochemicznych (test ELISA, immunobloting) i instrumentalnych (cytometria przepływowa) w układach z lipopolisacharydami o różnych typach rdzenia oraz w reakcji z pełnymi komórkami bakteryjnymi.

          Przeprowadzono taki sam zestaw eksperymentów dla surowicy uzyskanej na pełne komórki bakteryjne E. coli J5, a następnie porównano swoistości serologiczne obu surowic. W każdym przypadku surowica antykoniugatowa charakteryzowała się znacznie wyższą aktywnością.

Wypreparowano oligocukry rdzeniowe pochodzące od mutantów Salmonella Rb1, Rb2, Rc, Rd1, Rd2, Re. Posłużą one do określenia epitopów rozpoznawanych przez surowice odpornościowe, co pozwoli wyjaśnić obserwowaną wcześniej słabą reakcję surowicy anty-OS J5-TT z LPS macierzystego dla mutanta J5 szczepu E. coli O111:B4, a nieoczekiwanie mocną wobec oligocukrów typu R2 i R4.

Wstępne wyniki badań wskazują na właściwości ochronne surowicy anty-OS J5--TT w odpowiednich układach modelowych in vitro i in vivo w testach monitorujących poziom aktywnych mediatorów (TNF, IL-6, NO) związanych z objawami szoku endotoksycznego.

          Wyniki badań będą stanowić ważny element pojawiających się ostatnio informacji wyjaśniających sprzeczne wyniki prób z surowicami skierowanymi na szorstki szczep E. coli J5. Będą także uzupełnieniem już istniejącej charakterystyki glikokoniugatów pozostałych typów rdzeni w obrębie gatunków E.coli i Salmonella (R1, R2, R3, R4, Ra).

24. Projekt badawczy nr 6P04A 018 14 (1.03.1998-1.03.1999)
Lokalizacja glikolipidów głównych w bakteryjnych osłonach komórkowych - znaczenie w identyfikacji patogenów oportunistycznych i w serodiagnostyce zakażeń promieniczopodobnych
Kierownik projektu badawczego: mgr Anna Grzegorzewicz
Laboratorium Mikologii

          Wstępne badania nad lokalizacją glikolipidów głównych Propionibacterium propionicum miały na celu wykazanie, czy są one łatwo dostępne dla komórek immunologicznie kompetentnych. Zastosowano dwie uzupełniające się metody: sero­logiczną i fizykochemiczną. Stosując metodę serologiczną inkubowano nieuszkodzone komórki i surowe ściany komórkowe (sakulusy) z poliwalentną surowicą odpornoś­ciową. Utworzone kompleksy immunologiczne izolowano i dysocjowano za pomocą rodanku potasu. Poziom swoistych przeciwciał antyglikolipidowych w otrzymanych dysocjatach oznaczano za pomocą testu ELISA z użyciem antygenów glikolipidowych G_P2 i G_P3 Poziom przeciwciał uwolnionych z komórek nieuszkodzonych był nieznacz­nie wyższy, aniżeli tych, które pochodziły z sakulusów. Wyniki te przemawiały za powierzchniowym umiejscowieniem badanych glikolipidów. Dla porównania użyto również glikolipidów Nocardiopsis dassonvillei (G_N1  i G_N2 ) i Rhodococcus equi (G_R). Druga z metod opierała się na rozwarstwieniu biomasy komórkowej, za pomocą wirowania i ultrawirowania w gradiencie sacharozy, a następnie wykazaniu we frak­cjach obecności bądź braku glikolipidów. Uzyskane wyniki potwierdziły, że markery te są eksponowane na powierzchni komórek Propionibacterium propionicum.

          Powierzchniowa lokalizacja chemiotaksonomicznych makerów glikolipido­wych, biologicznie aktywnych, poszerza spektrum możliwości ich wykorzystania nie tylko we współczesnej klasyfikacji tych bakterii, lecz także w etiologii i w patogenezie wywoływanych przez nie zakażeń.

25. Projekt badawczy nr  4 P05A 084 15 (1.10.1998-30.06.1999)
Wpływ komórek NK na proliferację limfocytów T w mieszanej hodowli limfocytów
Kierownik projektu badawczego: lek. med. Bartosz Grzywacz
Laboratorium Immunologii Klinicznej

          W ramach realizowanego grantu porównano proliferację w MLC (Mixed Lymphocyte Culture) w obecności komórek NK i po ich eliminacji. Aby określić wpływ komórek NK na mieszaną hodowlę limfocytów oznaczono inkorporację radioaktywnie znakowanej tymidyny (metoda klasyczna), przy czym porównywano dwie równolegle prowadzone hodowle:

·       pełna populacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej respondera w hodowli z napromieniowanymi (dawką 30 Gy) allogenicznymi komórkami stymulatora,

·       populacja komórek respondera poddana procedurze eliminacji komórek NK przy użyciu mikrokulek magnetycznych „MACS-beads”.

          W 30 parach responder-stymulator porównano wynik testu MLC w obecności komórek NK i po ich eliminacji. Stwierdzono, że po eliminacji komórek NK wynik testu był wyższy w 5 kombinacjach i niższy w 7 kombinacjach. Jednak stosunkowo duże odchylenie standardowe pomiędzy powtórzeniami (5 powtórzeń w każdym teście) utrudnia statystyczną ocenę wyników.

          Zasadniczym celem projektu było wdrożenie alternatywnej metody oceny proliferacji komórek w mieszanej hodowli limfocytów. Jest to metoda oparta na barwieniu przeciwciałem Ki67. Rozpoznaje ono antygen o lokalizacji jądrowej i cytoplazmatycznej obecny w komórkach w cyklu podziałowym, nieobecny w komór­kach w fazie spoczynkowej G0. Barwienie przeciwciałem Ki67 skoniugowanym bezpośrednio z fluorochromem (FITC lub PE) wymaga uprzedniej permebilizacji. Wykorzystano do tego celu zestaw do permebilizacji produkcji firmy Immunosource. Oceniano jednocześnie fenotyp komórek przez barwienie przeciwciałami na markery powierzchniowe: CD3, CD56, NKB1 i CD158b.

          Dzięki temu możliwe było stwierdzenie, że:

1. komórki CD56+ CD3- proliferujące w mieszanej hodowli limfocytów, stanowiły 1-8%, przy czym ekspresja antygenu Ki67 była wykrywalna w komórkach CD56 bright (o wysokim poziomie obecności markera CD56 na komórce), natomiast komórki CD56 dim (o niskiej ekspresji CD56) były w przeważającej części w fazie spoczynkowej po 6-dniowej hodowli z allogenicznymi komórkami stymulatora.

2. Po hodowli z komórkami autologicznymi w roli stymulatora nie stwierdzono ekspresji Ki67 w komórkach, co dowodzi że proliferacja komórek NK w mieszanej hodowli limfocytów wynika z alloreaktywności.

3. W serii eksperymentów zastosowano suplementację hodowli rekombinowaną ludzką IL-2 w stężeniu 20 i.u./ml i 50 i.u./ml. W takich warunkach komórki NK (CD56+ CD3-) stanowiły do 20% komórek proliferujących, a do 60% limfocytów T (CD3+) wykazywało ekspresję CD56.

4. W hodowli suplementowanej IL-2 znaczna część komórek wykazywała obecność na powierzchni receptorów z rodziny KIR (Killer Inhibitory Receptors) CD158a i NKB1.  Występowały one głównie na komórkach CD3-, które stanowiły 1-12% żywych komórek respondera.

26. Projekt badawczy nr 4 P05B 008 15 (01.07.1998-30.06.1999)
Wpływ stymulacji przeciwciałem monoklonalnym anty-CD3 na ekspresję antygenu CTLA-4 (CD152) na powierzchni limfocytów krwi obwodowej u osób zdrowych i chorych na ziarnice złośliwą w różnych fazach choroby
Kierownik projektu badawczego: lek. med. Agata Kosmaczewska
Laboratorium Immunopatologii

          Ziarnica złośliwa (choroba Hodgkina) jest chorobą rozrostową układu limfo­retikularnego, związaną z zaburzeniami odporności komórkowej. Zaburzenia te przyczyniają się do zwiększonej zachorowalności na ciężkie infekcje grzybicze, wirusowe i pasożytnicze, wikłające w znacznym stopniu przebieg choroby.

          Celem badania było określenie ekspresji antygenu CTLA-4 na powierzchni limfocytów T stymulowanych przeciwciałem monoklonalnym anty-CD3 i IL-2 w 24, 48 i 72-godzinnych hodowlach komórek od chorych na ziarnicę złośliwą w aktywnej fazie choroby (APh) i w remisji klinicznej (CR) w porównaniu z grupą osób zdrowych (C) oraz określenie ewentualnej zależności między ekspresją antygenu CTLA-4 na powierzchni obwodowych limfocytów T (CD3+) a stopniem aktywności choroby i związanymi z nią zaburzeniami odporności komórkowej.

          Badania przeprowadzono u 22 osób w aktywnej fazie choroby, w III i IV stadium zaawansowania klinicznego uprzednio nie leczonych (APh), 13 chorych w całkowitej remisji klinicznej (CR) i u 19 osób zdrowych, wiekiem i płcią odpowia­dających badanej grupie chorych, stanowiących grupę kontrolną (C).

Komórki jednojądrzaste (PBMC) izolowano z heparynizowanej krwi obwodowej na gradiencie Gradisolu L, a następnie płukano dwukrotnie w PBS. Ekspresję antygenu CTLA-4 na powierzchni komórek T oznaczano przed i po stymulacji przeciwciałem monoklonalnym anty- CD3 i IL-2 metodą podwójnej immunofluorescencji w cyto­metrze przepływowym. Wyniki przedstawiono jako odsetek komórek podwójnie pozytywnych odczytywany z wykresu kropkowego dla wybramkowanej populacji 10 000 komórek.

·       Uzyskane wyniki badań wskazują, że na powierzchni spoczynkowych limfocytów CD3+ stwierdzono jedynie śladową ekspresję antygenu CTLA-4 we wszystkich badanych grupach. Po stymulacji limfocytów T odsetek komórek CTLA-4+/CD3+ w dniu szczytowej ekspresji wynosił odpowiednio: 15,58% (APh), 10,35% (CR)
i 5,22% (C).

·       Ekspresja antygenu CTLA-4 na powierzchni komórek T w grupie pacjentów APh i CR była wyraźnie wyższa niż grupie kontrolnej (C) (p=0,001).

·       Również wykazano istotne statystycznie różnice pomiędzy średnim odsetkiem komórek CTLA-4+/CD3+ w grupie chorych APh i CR (p=0,01).

·       Ponadto u 10/22 pacjentów w aktywnej fazie choroby (APh) i 9/13 chorych w remisji klinicznej (CR) stwierdzono zmiany kinetyki ekspresji powierzchniowej antygenu CTLA-4, polegające na pojawianiu się szczytowej ekspresji po 24 godz. stymulacji, podczas gdy w grupie kontrolnej osób zdrowych maksymalny poziom ekspresji CTLA-4 na limfocytach T (CD3+) obserwowano po 72 godz. hodowli z dodatkiem stymulantów.

          Ponadto statystycznie istotne różnice w nasileniu ekspresji powierzchniowej CTLA-4 na komórkach CD3+ pomiędzy grupą chorych APh i CR wskazują, że odsetek komórek podwójnie pozytywnych CTLA-4+/CD3+ we krwi obwodowej może stanowić ważny wskaźnik prognostyczny, świadczący o aktywności procesu cho­robowego.

27. Grant nr 6 P04B 005 17 (01.11.99 - 30.04.2000)
Otrzymywanie przeciwciał poliklonalnych przeciwko białku tioesterazy II ze Streptomyces coelicolor A3(2)
Kierownik projektu badawczego: mgr inż. Magdalena Kotowska
Laboratorium Biologii Molekularnej Mikroorganizmów

          Projekt jest częścią badań zmierzających do wyjaśnienia roli biologicznej nowej syntazy poliketydowej typu I oraz białka tioesterazy II ze Streptomyces coelicolor A3(2). Badania są prowadzone w kilku etapach, z których zrealizowano następujące:

Uzyskanie białka fuzyjnego. Fragment genu tioesterazy, kodujący region przy­puszczalnego centrum aktywnego enzymu, klonowano w wektorze ekspresyjnym pGEX-KG. Klonowanie przeprowadzono w odpowiedniej ramce odczytu tak, aby 3’-koniec genu tioesterazy stanowił koniec 5’ genu glutationo-S-transferazy. Komórki E. coli DH5a transformowano skonstruowanym plazmidem a następnie wyselekcjo­nowano klony rekombinantów. Przeprowadzono ekspresję genu białka fuzyjnego w komórkach E. coli poddanych indukcji i dobrano warunki optymalnej ekspresji.

Oczyszczanie białka fuzyjnego metodą chromatografii powinowactwa. Obecność glutationo-S-transferazy na N-końcu otrzymywanego białka pozwoliła na oczysz­czenie białka fuzyjnego przy wykorzystaniu powinowactwa GST do glutationu. Pierwszą porcję oczyszczonego białka fuzyjnego użyto do immunizacji królików.

          W toku dalszych badań zostanie przeprowadzona kolejna immunizacja królików, izolacja przeciwciał, oznaczenie ich miana oraz zastosowanie uzyskanych przeciwciał w badaniu ekspresji genu tioesterazy II w komórkach Streptomyces coelicolor A3(2).

28. Grant nr 4 P05B 047 16 (01.01.1999-30.11.1999)
Ligand Fas (FasL) jako potencjalny marker prognostyczny
w ludzkim raku piersi
Kierownik projektu badawczego: lek. med. Joanna Koźlak
Laboratorium Oddziaływań Międzykomórkowych

          Celem projektu było wykazanie ekspresji na komórkach raka piersi ekspresji liganda Fas i zbadanie czy jego obecności towarzyszy zwiększona liczba komórek apoptotycznych w guzie nowotworowym.

          Materiał operacyjny otrzymano z pięćdziesięciu guzów piersi kobiet operowa­nych na Oddziale Chirurgii Dolnośląskiego Centrum Onkologii (ordynator: dr Marek Bębenek).

          Jednym ze szlaków indukujących apoptozę jest para: receptor Fas/APO-1 (CD95) oraz jego ligand - FasL. Ligand Fas jest białkiem, należącym do rodziny czynników martwicy nowotworów . Może on być funkcjonalnie aktywny zarówno w postaci białka błonowego, na powierzchni komórki, jak również w płynach ustrojo­wych, po złuszczeniu z komórki. Związanie liganda z receptorem powoduje włączenie procesu apoptozy w komórkach posiadających na swojej powierzchni aktywny receptor - Fas. W warunkach prawidłowych jest to ważny mechanizm efektorowy, wykorzystywany przez cytotoksyczne limfocyty T i komórki NK. Apoptoza oceniana była po zabarwieniu potraktowanych RNAzą komórek jodkiem propidyny /PI/, metodą cytofluorometrii przepływowej, za pomocą aparatu FASCalibur (Becton Dickinson). Z pozostałej części materiału sporządzone były skrawki mrożone, służące do oznaczeń immunohistochemicznych ekspresji FasL i antygenu Lewis Y.

          Badania immunohistochemiczne, przeprowadzone z wykorzystaniem metody peroksydazowej, ujawniły, że w całym materiale 52% preparatów wykazywało ekspresję FasL, natomiast w 68% preparatów występował antygen LeY.

          Dotychczasowe opracowania wskazują, że apoptoza w materiale biopsyjnym kształtowała się średnio na poziomie 10%, a jej wielkość była nie związana w zakresie istotnym statystycznie z ekspresją FasL. Okazało się, że procent komórek apopto­tycznych mierzony przy użyciu FASC w tkankach z ekspresją FasL, oraz w tkankach bez tej ekspresji był zbliżony i wynosił odpowiednio 10,5% i 8,9%.

29. Projekt badawczy nr 4 P05A 035 16 (1.04.1999-29.02.2000)
Badanie wpływu przeciwciał anty-LPS na retencję komórek w płucach indukowaną przez endotoksynę
Kierownik projektu badawczego: lek. med. Ryszard Międzybrodzki
Laboratorium Immunofarmakologii

          Wykonano pierwszy etap badań, w którym określono zależność efektu zatrzy­mania komórek od szczepu myszy, czasu podania i dawki LPS oraz optymalny czas pomiaru radioaktywności płuc po podaniu piętnowanych komórek (YAC-1, limfo­cyty). Ustalono dawkę endotoksyny, dla której po uwrażliwieniu myszy szczepu Balb/c na działanie LPS (przez dożylne podanie liofilizatu Propionibacterium acnes), będzie badany wpływ przeciwciał anty-LPS na retencję komórek wywołaną podaniem LPS.

30. Projekt badawczy nr 4 P05A 076 15 (1.12.1998 - 30.09.1999)
Wpływ własnych peptydów ustroju na odpowiedź limfocytów T
na obcy peptyd antygenowy
Kierownik projektu badawczego: mgr Izabela Nowak
Laboratorium Immunogenetyki

          Celem projektu było uzyskanie odpowiedzi na pytanie, jaki wpływ na odpowiedź limfocytów T CD4+ na obcy peptyd antygenowy prezentowany przez cząsteczkę MHC klasy II ma obecność, na komórkach prezentujących antygen, naturalnie związanych peptydów pochodzących z własnych białek ustroju. Jako komórki prezentujące antygen zastosowaliśmy mysie fibroblasty Ltk-/-: a) nie transfekowane (kontrola ujemna); b) transfekowane rekombinowanymi genami dla cząsteczki MHC klasy II z haplotypu H-2^b (A^b), związanej kowalencyjnie z peptydem Ep 52-68 pochodzącym z cząsteczki I-E nieobecnej w haplotypie H-2^b (zwane dalej A^bEp); c) transfekowane genami dla cząsteczki A^b typu dzikiego (zwane dalej A^bwt); d) transfekowane genami A^bwt i genami A^bEp (zwane dalej A^bwt+A^bEp).

          Test cytofluorymetrii przepływowej wykazał, że na wszystkich transfeko­wanych fibroblastach występuje zbliżona ilość A^b, a Ep tylko na fibroblastach A^bEp i A^bwt+A^bEp.

          Komórkami odpowiadającymi były komórki śledzionowe od myszy B6 (H-2^b) immunizowanych peptydem Ep w pełnym adiuwancie Freunda oraz komórki hybrydoma Ea16.3 rozpoznające Ep prezentowany przez A^b. Reakcję badano testem wbudowania ³H-TdR. Na ogół nie zaobserwowano efektu immunizacji, tzn. komórki od zwierząt immunizowanych i nie immunizowanych odpowiadały jednakowo na fibroblasty A^bEp, a nie odpowiadały na A^bwt ani A^bwt+A^bEp. Jedynie w cztero­dniowej hodowli w 6 dni po immunizacji zaobserwowano odpowiedź na A^bwt+A^bEp choć słabszą niż na A^bEp, podczas gdy komórki od myszy nie immunizowanych odpowiedziały tylko na A^bEp. Komórki hybrydoma Ea16.3 (kontrola dodatnia) odpowiadały w 3 i 4 dniu hodowli jednakowo na fibroblasty A^bEp i A^bwt+A^bEp, a w 6 dniu już tylko na A^bEp.

          Komórki od myszy immunizowanych i nie immunizowanych nie produkowały IL-2. Komórki hybrydomy Ea16.3 w odpowiedzi na antygen wydzielały IL-2. Fibroblasty A^bwt+A^bEp pobudzały hybrydomę do silniejszej odpowiedzi niż fibro­blasty A^bEp. Zjawisko to nie było zależne ani od liczby komórek hybrydomy, ani od liczby fibroblastów.

Wyniki te nie potwierdziły założonej hipotezy, że obecność innych peptydów zahamuje odpowiedź na swoisty peptyd antygenowy. Wydaje się to być bardzo interesujące i wymaga dalszych badań z zastosowaniem większego zbioru komórek prezentujących i odpowiadających oraz komórek od myszy transgenicznych.

31. Projekt badawczy nr 6 PO4A 028 16 (01.05.1999 - 29.02. 2000)
Identyfikacja antygenów grupowych A i B w komponencie cukrowej
glikoforyny A
Kierownik projektu: mgr inż. Maria Podbielska
Laboratorium Immunochemii Glikokoniugatów

            Zgodnie z przewidzianym harmonogramem prac wykonano preparację surowej frakcji glikoforyny A metodą wodno-fenolowej ekstrakcji membran i jej oczyszczanie w celu przygotowania materiału do badań. Z wypreparowanych w ten sposób pre­paratów GPA-A (pochodzącego z krwinek grupy A) i GPA-B (pochodzącego z krwinek grupy B) izolowano łańcuchy cukrowe za pomocą b-eliminacji w warunkach redukujących, a produkty tej degradacji rozdzielano metodą filtracji żelowej. Uzys­kano w ten sposób frakcje wolnych, zredukowanych O-glikanów oraz N-glikanów w postaci glikopeptydów. Te ostatnie zostały poddane drastycznej degradacji alkalicznej w celu pozbawienia części białkowej. Wyniki analizy cukrowej preparatów O-glik i N-glik wykazały obecność monocukrów typowych dla łańcuchów O-glikozydowych -Gal i GalNAc oraz dla N-glikozydowych - Fuc, Man, Gal i GlcNAc.

          Przeprowadzono również analizę metodą immunoblotingu. Metoda ta wykazała wyraźnie, że pasma odpowiadające glikoforynie barwią się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych anty-A i anty-B. W uzupełniającym doświadczeniu bloty inkubo­wano w warunkach umożliwiających usunięcie łańcuchów O-glikozydowych z gliko­foryny. Wykazano, że antygeny grupowe są obecne również w łańcuchach N-gliko­zydowych nie usuwanych w zastosowanych warunkach z cząsteczki glikoforyny.

          Frakcje O-glikanów i N-glikanów zostały następnie użyte jako inhibitory w teście hamowania aglutynacji, przy czym sprawdzono po kilka niezależnie otrzymanych preparatów tej samej grupy, A lub B. Okazało się, że preparaty N-glikanów znacznie lepiej hamują aglutynację w porównaniu z O-glikanami, co mogłoby wskazywać na fakt, że odpowiednie antygeny grupowe występują w łańcuchach N-glikozydowych w ilości kilkakrotnie większej niż w łańcuchach O-glikozydowych. Ponadto O-glikany pochodzące z GPA-A hamowały aglutynację wyraźnie silniej niż O-glikany z GPA-B.

          We współpracy z prof. Bo Nilssonem w Umea w Szwecji wykonano analizy przy użyciu spektrometru masowego w systemie electrospray. Dla próbki odsjalo­wanych O-glikanów z GPA-A uzyskano m.in. jon 1389, który analizowany metodą MS/MS dostarczył zestawu jonów sekwencyjnych potwierdzających obecność zredukowanego heksasacharydu, zawierającego antygen grupowy A. Dla analogicznej próbki z GPA-B uzyskano jon 1357. Jon ten z kolei dostarczył zestawu jonów sekwencyjnych potwierdzających obecność determinanty grupowej B. W przypadku analizy N-glikanów dysponujemy już wynikami dla pochodnych permetylowanych. Dla próbki pochodzącej z GPA-A uzyskano m.in. jon m/z 1649, a dla próbki z GPA-B jon m/z 1629, oba w postaci adduktów amonowych podwójnie zjonizowanych. Masy tych jonów odpowiadają strukturom dwuantenowym, przy czym jedna z anten jest zakończona odpowiednim antygenem grupowym, a druga resztą kwasu sjalowego.

Projekty badawcze zamawiane,
których realizacje rozpoczęto we wrześniu 1999 r.

W ramach zamawianego projektu badawczego pt.

„Nowe techniki biologii molekularnej o podstawowym znaczeniu w technologii transferu genów”
Kierownik projektu: prof. dr hab. Andrzej Mackiewicz, AM Poznań

rozpoczęto przygotowania do następujących tematów badawczych:

1. Modyfikowane genetycznie komórki dendrytyczne, krwiotwórcze i nowo­tworowe do skojarzonej chemio- i immunoterapii przeciwnowotworowej
Doc. dr Danuta Duś (1.09.1999-31.08.2002)

2. Wykorzystanie antygenów towarzyszących nowotworom: sjalo-Lewis^a i CEA jako celów genowej terapii przeciwnowotworowej

Doc. dr Maciej Ugorski (1.09.1999-31.08.2002)

Udział Instytutu w programach międzynarodowych
(granty zagraniczne)

1.     „Struktura i immunologiczne badania polisacharydów bifidobakterii”
Doc. dr Andrzej Gamian,      (1998-2000)
(współpr. z Instytutem Mikrobiologii NANB, Mińsk, Białoruś)

2.     ”Biologia molekularna promieniowców i kręgowców lądowych”
Prof. dr Marian Mordarski    (1996-2000)
(współpr. z Instytutem Mikrobiologii CHAN, Pekin, Chiny)

3.     „Rola laktoferyny w oddziaływaniu na odpowiedź immunologiczną.
Immunotropowe właściwości laktoferyny”
Prof. dr Michał Zimecki     (1999)
(współpr. z Lab. Chemii Biologicznej Uniwersytetu w Lille, Francja)

4.     „Analiza strukturalna glikokoniugatów powierzchni komórki nowotworowej.
Poszukiwania korelacji pomiędzy zaburzeniami glikozylacji a fenotypem
inwazyjnym i przerzutowym komórki nowotworowej”
Doc. dr Danuta Duś     (1999)
(współpr. z Lab. Chemii Biologicznej Uniwersytetu w Lille, Francja)

5.     „Rola komórek śródbłonka naczyniowego w lokalizacji przerzutów
nowotworowych. Możliwości terapii antyprzerzutowej poprzez modyfikację
międzykomórkowych oddziaływań adhezyjnych”
Doc. dr Danuta Duś     (1999 - Polonium)
(współpr. z Lab. Glikokoniugatów i Lektyn Endogennych Centrum Biofizyki
Molekularnej CNRS i Uniwersytetu w Orleanie, Francja)

6.     „Niedobór magnezu i reakcja zapalna”
Doc. dr Maciej Ugorski        (1999 - Polonium)
(współpr. z Unite Maladies Metaboliques et Micronutriments C. Remesy,
St. Genes Champanelle, Francja)

7.     „Badania nad rolą komórek CD57+ we wtórnych niedoborach odpornościowych
(zakażenia wirusowe, przeszczepy szpiku)”
Prof. dr Andrzej Lange           (1999 - Polonium)
(współpr. z Institute Paris-Sud sur les Cytokines, Clamart, Francja)

8.     „Inicjacja replikacji DNA u Streptomyces; oddziaływanie białka dnaA z oriC,
regionem inicjacji replikacji DNA”
Doc. dr Jolanta Zakrzewska-Czerwińska (1996-2000)
(współpr. z Instytutem Maxa Plancka w Berlinie, Berlin, Niemcy)

9.     „Ekspresja genów cytokinowych w chorobach płuc”
Prof. dr Andrzej Lange           (1993-1999)
(współpr. z Instytutem Eksperymentalnej Biologii i Medycyny, Borstel, Niemcy)

10. „Badania strukturalne i serologiczne antygenów bakteryjnych”
Prof. dr Czesław Ługowski     (1999)
(współpr. z Zakładem Chemii Uniwersytetu Rolniczego, Uppsala, Szwecja)

11. „Identyfikacja antygenów grupowych A oraz B w glikoforynie ludzkiej”
Doc. dr Hubert Krotkiewski  (1999)
(współpr. z FOA-Defence Research Establishment, Umea, Szwecja)

Szczegółowe omówienie ww. projektów badawczych umieszczono w rozdziale „V. Współpraca naukowa z ośrodkami krajowymi i zagranicznymi”.

Współpraca Instytutu z Akademią Medyczną we Wrocławiu
w ramach grantów KBN

1.     Katedra i Klinika Endokrynologii AM we Wrocławiu
Kierownik projektu: dr med. Jacek Daroszewski
Współwykonawcy z IITD -  Lab. Oddziaływań Międzykomórkowych
(dr. M. Paprocka); Lab. Mikrobiologii Lekarskiej (doc. A. Gamian)
Temat: „Zastosowanie pomiaru glikozaminoglikanów w moczu i surowicy w monitorowaniu leczenia pacjentów z orbitopatią endokrynną”, 1999 - 2002

2.     I Katedra i Klinika Ginekologii AM we Wrocławiu, ul. Chałubińskiego 3
Kierownik projektu: dr med. Marian Gryboś
Współwykonawcy z IITD - Lab. Immunologii Klinicznej
(prof. A. Lange i mgr I. Kryczek)
Temat: „Badania zależności pomiędzy ekspresją protoonkogenów (bcl-2, erbB2) i produkcją interleukiny 6 przez komórki nowotworowe raka jajnika a ich wrażliwością na chemio/immunoterapię”, 1997 - 1999

4.     Zakład Chemii Organicznej AM we Wrocławiu
Kierownik projektu: dr Stanisław Ryng
Współwykonawca z IITD - Lab. Immunobiologii (prof. M. Zimecki)
Temat: „ Synteza, aktywność biologiczna i struktura nowych pochodnych izoksazolowych o potencjalnej aktywności immunomodulacyjnej”, 1998 - 2001

7.     Katedra i Klinika Hematologii Chorób Rozrostowych AM we Wrocławiu
Kierownik projektu: dr hab. Dariusz Wołowiec
Współwykonawcy z IITD - Lab. Immunopatologii
(dr L. Ciszak, lek. med. D. Boćko i lek. med. A. Kosmaczewska)
Temat: „Zależność między proliferacją i apoptozą a obrazem klinicznym przewlekłej białaczki limfatycznej”, 1999 - 2001

Współpraca Instytutu z Akademią Medyczną we Wrocławiu
w ramach grantów międzynarodowych

1.     Zakład Anatomii Patologicznej AM
Kierownik projektu: dr Piotr Ziółkowski
Współwykonawca z IITD -  Lab. Wirusologii (dr E. Piasecki)
Temat: „Opracowanie nowych związków selenoorganicznych jako modyfikatorów wybranych procesów komórkowych” w ramach grantu międzynarodowego pt. „Blood sterylization using photo- dynamic effect with immobilized photosensitizers”, Uniwersytet w Barcelonie

Współpraca Instytutu w ramach grantów własnych Akademii Medycznej

1.     Klinika i Katedra Neurologii AM, ul. Traugutta
Kierownik projektu: dr med. Maria Ejma
Współwykonawcy z IITD - Lab. Immunofarmakologii
(doc. S. Szymaniec, lek. med. W. Fortuna, lek. med. R. Międzybrodzki)
Temat: „Neurologiczne zespoły paranowotworowe, badania immunologiczne, kliniczne i elektrofizjologiczne” - 1999 r.

3.     II Klinika i Katedra Ginekologii AM, ul. Dyrekcyjna
Kierownik projektu: lek. med. Marcin Jędryka
Współwykonawca z IITD - Lab. Immunofarmakologii
(lek. med. R. Międzybrodzki)
Temat: „Aktywność cytokinowa płynu otrzewnowego kobiet z niepłodnością niejasnego pochodzenia„ - 1999 r.

Współpraca Instytutu z Akademią Medyczną we Wrocławiu
na podstawie dwustronnych porozumień

2.     Katedra Onkologii i Klinika Ginekologii Onkologicznej AM we Wrocławiu
Wykonawca z AM - prof. dr J. Kornafel
Współwykonawcy z IITD - Lab. Immunobiologii (prof. M. Zimecki);
Lab. Immunopatologii (prof. I. Frydecka, lek.med. A. Kosmaczewska
i lek. med. D. Boćko)
Temat: „Wpływ laktoferyny - naturalnego immunomodulatora - na parametry odpowiedzi odpornościowej u chorych na schorzenia nowotworowe” - 1999-2001

4.     Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych AM we Wrocławiu
Współwykonawcy z IITD - Lab. Immunopatologii (prof. I. Frydecka,
lek. med. A. Kosmaczewska i lek. med. D. Boćko)
Temat: ”Wpływ stymulacji przeciwciałem monoklonalnym anty CD3 na ekspresję antygenu CTLA-4 na powierzchni limfocytów  krwi obwodowej u chorych na schorzenia nowotworowe” - 1999 r.

5.     Zakład Histologii i Embriologii AM we Wrocławiu

Wykonawca z AM - prof. dr Maciej Zabel
Współwykonawca z IITD - Zakład Immunologii Nowotworów IITD
(prof. dr C. Radzikowski)
Tematy:
1. Udział neoangiogenezy w procesie progresywnego wzrostu i przerzutowania,
2. Mechanizm indukowania różnicowania komórek nowotworowych pod wpływem witaminy D i jej nowych analogów, w szczególności badania nad receptorami dla kalcitriolu w komórkach podatnych na indukcję apoptozy

IV. Opracowane metody badawcze i patenty

1.     Opracowano uproszczoną procedurę oczyszczania fimbrii bakteryjnych i wykorzystania tych białek jako nośników do szczepionek przeciwbakteryjnych
Kierownik zespołu badawczego: doc. dr Andrzej Gamian

2.     Opracowano metodę F-SSCP (Fluorescent Single Strand Conformational Polymorphism) do badania polimorfizmu interleukiny 10 (IL-10)
Kierownik zespołu badawczego: prof. dr Andrzej Lange

4.     Wykazano, że elutriacja może znaleźć zastosowanie do oczyszczania preparatu transplantacyjnego krwi obwodowej z limfocytów T
Kierownik zespołu badawczego: prof. dr Andrzej Lange

5.     Wykazano, że komórki progenitorowe prolipotencjalne i multipotencjalne charakteryzują się różną gęstością co umożliwia uzyskanie odpowiednio wzbogaconych subpopulacji metodą elutriacji
Kierownik zespołu badawczego: prof. dr Andrzej Lange

6.     Wykazano, że komórki NK rozpoznają obce limfocyty w hodowli MLC wykorzystując uwarunkowanie specyficzności locus B KIR-y w obecności IL-2
Kierownik zespołu badawczego: prof. dr Andrzej Lange

7.     Patent RP nr 175310 z dn. 31.12.1998 r.
Stec W.J., Radzikowski C., Szelejewski W., Kinas R., Misiura K., Grynkiewicz G., Kuśnierczyk H., Kutner A. & Pilichowska S.:
Środek farmaceutyczny przeciwnowotworowy

8.     Zgłoszenie patentowe - 1999 r.:
Opolski A., Radzikowski C., Kutner A.:
Sposób działania syntetycznych analogów cholekalcyferolu