II. Badania statutowe
w zakresie wiodącego tematu:

„KOMÓRKOWE I MOLEKULARNE PODSTAWY
PROCESÓW IMMUNOLOGICZNYCH”

Zakład Immunologii Nowotworów

Temat nr 1

Badania nad udziałem apoptozy, która jak przyjmujemy – może być zahamowana w komórkach limfoidalnych stransformowanych in vitro pod wpływem stosowanego kompleksu b-cyklodekstryna-pristan

Laboratorium Immunologii Nowotworów, kierownik: prof. dr Czesław Radzikowski

          W hodowlach in vitro mysich komórek śledzionowych myszy szczepu BALB/c, w obecności rozpuszczalnej w środowisku wodnym postaci pristanu (kompleks z b-cyklodekstryną) uzyskano (42%) stransformowane nowotworowo linie komór­kowe. Komórki tych linii okazały się tumorogenne po przeszczepieniu do syn­genicznych myszy. Badanie antygenów powierzchniowych komórek dwóch linii nowotworowych SN-1 i SN-2 wskazują na ich monocytarno-makrofagowe pocho­dzenie. Odpowiedź tych komórek na indukcję apoptozy badano inkubując je z 40 mM etapozydem przez 2 i 5 godzin. Komórki okazały się niewrażliwe na indukcję apoptozy. W badanych komórkach nowotworowych wykazano niską ekspresję pro­duktu genu supresorowego p53 oraz brak ekspresji białka genu Bcl-2.

Wykonawcy: dr J. Salwa, dr P. Załęcki

Temat nr 2

Badanie szlaków sygnałowych aktywowanych w komórkach HL-60 przez związki wywołujące ich różnicowanie

Laboratorium Immunologii Nowotworów, kierownik: prof. dr Czesław Radzikowski

          W roku sprawozdawczym kontynuowano prace dotyczące poznania mechaniz­mu działania na poziomie komórkowym związku indukującego różnicowanie się komórek: kalcitriolu, czyli 1,25-dwuhydroksywitaminy D₃. Praca ta miała charakter poznawczy. Ponadto kontynuowano badania porównawcze analogów kalcitriolu mające na celu selekcję związków o najwyższym potencjale indukcji różnicowania komórek białaczkowych. Celem tych badań było wyselekcjonowanie związków do określenia ich aktywności przeciwnowotworowej i przeciwłuszczycowej.

          W poprzednio opublikowanych pracach wykazano, że wewnątrzkomórkowe sygnały inicjowane przez kalcitriol aktywują za pośrednictwem kinazy białkowej C (PKC) kinazę MAP. Próbowano rozstrzygnąć, czy aktywacja tych dwóch kinaz jest niezbędna do inicjowanego przez kalcitriol procesu różnicowania. Ponieważ sto­sowany uprzednio inhibitor PKC, bisindolylmaleimid II (BIM), nie blokował różnico­wania, zastosowano kolejne inhibitory, aby wyjaśnić czy poprzednie (zaskakujące) wyniki były swoiste i prawdziwe, czy wynikały z niskiej specyficzności inhibitora. W doświadczeniach zastosowano inhibitory PKC, mianowicie D-sfingozynę i jej pochodną DL-erytrodihydrosfingozynę, natomiast kinazę MAP blokowano związkiem PD98059. Czynniki te stosowano w stężeniach znanych z aktywacji blokujących ki­nazy oraz w stężeniach wyższych od rekomendowanych, lecz poniżej granicy toksycz­ności dla komórek. Uzyskane wyniki potwierdzają, że zablokowanie szlaku sygnało­wego PKC/MAPK nie powoduje istotnego hamowania procesu różnicowania komórek.

          Wiadomo z naszych poprzednich badań, że szlak PKC/MAPK jest bardzo silnie aktywowany przez płodową surowicę bydlęcą (FCS). Postanowiono wyjaśnić, czy możliwe jest aby proces różnicowania przebiegał w komórkach o obniżonej zdolności do proliferacji, to znaczy w medium hodowlanym całkowicie pozbawionych FCS. Okazało się, że obecność FCS nie jest niezbędna do inicjowania przez kalcitriol różnicowania komórek HL-60, a maksymalny wzrost ekspresji antygenu CD11b osiągany jest przy stężeniu 2,5% FCS. Być może kalcitriol generuje „własny” sygnał mitogenny, który aktywuje szlak PKC/MAPK. Kolejne doświadczenia pozwalające przybliżyć się do zrozumienia tego problemu zostaną wykonane w przyszłości.

          Druga część wykonanych prac o charakterze aplikacyjnym miała na celu porównanie zdolności indukcji różnicowania komórek przez nowe analogi kalcitriolu. Wstępna selekcja wykazała, że z grupy badanych analogów dwa, oznaczone sym­bolami PRI-1906 i PRI-2191 cechują się aktywnością wyższą niż związek referen­cyjny, tj. kalcitriol. Ponadto oba preparaty wykazują istotnie obniżoną tzw. „aktywność wapniową”, czyli praktycznie nie wpływają na homeostazę wapniowo-fosforanową organizmu. Te dwa związki poddano bardziej szczegółowym badaniom, jednym z nich było oznaczanie zdolności do indukcji markerów różnicowania (CD11b i CD14) na komórkach HL-60 po 96-godzinnej ekspozycji na badane związki lub kalcitriol. Wyniki badań podane są w będącej w druku publikacji.

Wykonawcy: dr E. Marcinkowska, mgr A. Chrobak

Publikacja nr 48

Temat nr 3

Badania modelowe in vivo nad patogenezą procesu przerzutowania
z użyciem ludzkich oraz mysich linii nowotworowych z uwzględnieniem:
a) drogi przeszczepiania nowotworu (w tym przeszczepów ortotopowych)
b) ekspresji antygenu karcynoembrionalnego i sjalo Lewis^a

Laboratorium Immunologii Nowotworów, kierownik: prof. dr Czesław Radzikowski

Ad. a)

W okresie sprawozdawczym wykonano badania mające na celu:

1.     ustalenie rozmieszczenia przerzutów w zależności od lokalizacji guza pierwotnego uzyskanego po wszczepieniu komórek nowotworowych dootrzewnowo, pod­skórnie, dośledzionowo lub ortotopowo.

2.     zbadanie efektu przeciwnowotworowego genisteiny podawanej w fazie zaawanso­wanego wzrostu nowotworu jako uzupełnienie leczenia cytoredukcyjnego cyklo­fosfamidem (CY).

W badaniach stosowano pięć przeszczepialnych nowotworów mysich: gruczo­lakorak sutka 16/C (myszy C3H), czerniak B16 i B16F-10 (myszy C57BL/6), rak płuc pochodzenia nabłonkowego LL₂  (Lewis Lung Carcinoma) (myszy C57BL/6), rak jelita grubego C38 (myszy C57BL/6). Komórki pochodzące z hodowli in vitro lub uzyskane po przetarciu przez filtry biologiczne materiału z guza podskórnego, wszczepiano myszom podskórnie (s.c.), dootrzewnowo (i.p.), dożylnie (i.v.), śród­skórnie (i.d.), dosutkowo, dośledzionowo (i.s.), pod torebkę nerki (src) lub dojelitowo (i.i.). Schemat podania leków: cyklofosfamid (CY) – 100 mg/kg w dniu 4 po wszczepieniu nowotworu, genisteina – 100 mg/kg od dnia 4 po wszczepieniu nowotworu  przez 10 kolejnych dni, skojarzone leczenie – cyklofosfamid w dniu 4 po wszczepieniu nowotworu, genisteina od 3 dnia po podaniu cyklofosfamidu przez 10 kolejnych dni. Badania są w toku, zakończono doświadczenia na modelu raka płuc Lewis (LL₂). Po dożylnym podaniu komórek nowotworowych (LL₂) zaobserwowano statystycznie istotną redukcję liczby kolonii w płucach u myszy leczonych zarówno CY (81% zahamowania), genisteiną (94%), jak i po skojarzonej terapii obydwoma preparatami (85%). Po podskórnym podaniu komórek nowotworowych zaobserwo­wano statystycznie istotne zahamowanie wzrostu guza pierwotnego u myszy leczo­nych CY (48% zahamowania) oraz po skojarzonej terapii CY+genisteina (55%). Podanie samej genisteiny powodowało 34% zahamowanie wzrostu guza (p>0.05). W tej grupie myszy oszacowano również liczbę kolonii przerzutowych w płucach. Statystycznie istotną redukcję liczby kolonii zaobserwowano u myszy leczonych CY (82%) lub po skojarzonej terapii CY+genisteina (87%). Podanie genisteiny prowadziło do 45% redukcji liczby kolonii, różnica ta nie była istotna statystycznie w porównaniu z grupą kontrolną.

          Wyniki doświadczeń terapeutycznych z użyciem genisteiny i CY wskazują na fakt, że efektywność terapii jednolekowej, jak i skojarzonej terapii zależy od drogi podania nowotworu. Interesującą wydaje się również obserwacja synergicznego działania obydwu leków po ich skojarzonym zastosowaniu.

Ad. b)

Badania nad rolą antygenu sjalo LewisA w procesie przerzutowania prowa­dzono na modelu komórek ludzkich linii uroepitelialnych: HCV29T i Hu1703He przeszczepionych do myszy bezgrasiczych. Komórki tych linii różnią się w sposób istotny ekspresją tej cząsteczki: Hu1703He to linia o wysokiej ekspresji, a HCV29T to linia charakteryzująca się brakiem ekspresji sjalo LewisA.

          Uzyskane wyniki pozwalają na stwierdzenie, że ekspresja antygenu sjalo LewisA na komórkach badanych linii uroepitelialnych nie wpływa bezpośrednio na zdolność tych komórek do tworzenia przerzutów.

          Badania były częściowo dofinansowane z grantu KBN 4.PO5A.083.15.

          Wyniki badań były prezentowane na XXXV Zjeździe Polskiego Towarzystwa Bio­chemicznego w Olsztynie, Multidyscyplinarnej Konferencji Nauki o Leku w Muszynie i na 7^th  International Symposium on Molecular Aspects of Chemotherapy w Gdańsku.

Wykonawcy: dr A. Opolski i lek. wet. J. Wietrzyk przy współpracy
z doc. M. Ugorskim z Laboratorium Glikobiologii IITD

Publikacje nr: 100, 124, 141
Temat nr 4

Badanie aktywności przeciwwzrostowej in vitro i efektywności terapeutycznej in vivo nowych preparatów o przewidywanym działaniu przeciwnowotworowym

Laboratorium Immunologii Nowotworów, kierownik: prof. dr Czesław Radzikowski

Badania in vitro:

          W roku 1999 przeprowadzono badania in vitro pięciu grup związków chemicz­nych i preparatów zsyntetyzowanych i otrzymanych do badań w ramach współpracy z wymienionymi niżej ośrodkami:

1.     Instytut Farmaceutyczny w Warszawie (prof. Andrzej Kutner)  Calcitriol i jego pochodne oznaczone symbolami: PRI-1906, PRI-2193, PRI-2192, PRI-2194
i PRI-2191.

2.     Instytut Chemii WSP w Kielcach (dr Marek Wiśniewski) – Nowe pochodne platyny, rodu i palladu.

3.     Instytut Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie (doc. Irena Oszczapowicz) – Nowe pochodne antybiotyków antracyklinowych.

4.     Instytut Chemii Uniw. Wrocławskiego (prof. Janina Kuduk-Jaworska) – Nowe pochodne karboplatyny.

5.     Instytut Chemii Organicznej, Biochemii i Biotechnologii Polit. Wrocławskiej (doc. Wanda Peczyńska-Czoch) i Instytut Farmaceutyczny w Warszawie (prof. Łukasz Kaczmarek) – Nowe pochodne [2,3-b]indolochinoliny.

          Uzyskano następujące wyniki:

Ad. 1. Wszystkie badane pochodne kalcitriolu wykazały słaby efekt hamowania proliferacji komórek linii ludzkiego raka piersi T47D i MCF7 oraz ludzkiej białaczki promielocytarnej HL-60 i ludzkich fibroblastów. Wszystkie pochodne, jak również sam kalcitriol nie powodowały zahamowania proliferacji komórek pozostałych 14 testowanych ludzkich linii nowotworowych.

Ad. 2. Wyselekcjonowano kilka związków, które wykazywały aktywność cyto­toksyczną w badanym zakresie stężeń oraz spełniają warunki kryterium prze­siewowego (poziom ID₅₀ nie wyższy niż 4 mg/ml). Pozostałe preparaty były słabo aktywne lub nieaktywne.

Ad. 3. Badane preparaty z tej grupy to nowe pochodne, głównie morfolinowe, anty­biotyków antracyklinowych – daunorubicyny, doksorubicyny i epidoksorubicyny. Testowano 7 związków, spośród których wybrano 3 do dalszych badań aktywności antyproliferacyjnej in vitro wobec komórek mysich linii nowotworowych.

Ad. 4. Przeprowadzono badania in vitro związków oznaczonych symbolami 1–9 i karboplatyny. Badania przeprowadzono zarówno wobec komórek ludzkich linii nowotworowych jak i komórek wybranych nowotworów mysich. Wyselekcjonowano 3 związki do dalszych badań in vivo.

Ad. 5. Przeprowadzono badania nad aktywnością cytotoksyczną 15 nowych pochod­nych [2,3-b]indolochinoliny. Zdecydowana większość wykazała silną aktywność anty­proliferacyjną in vitro, a badania nad zależnością struktura – aktywność biologiczna pozwoliły na wybór kierunku syntez związków z odpowiednimi podstawnikami oraz miejscem ich podstawienia do zachowania lub wzmocnienia ich aktywności biologicznej.

Badania koniugatu metotreksatu z fibrynogenem

          Jednym z ważniejszych problemów w chemioterapii przeciwnowotworowej jest brak wybiórczości transportu leku do komórek nowotworowych. Próbuje się go roz­wiązać, m.in. poprzez użycie nośników o swoistym lub podwyższonym powino­wactwie do komórek nowotworowych, takich jak przeciwciała monoklonalne, liposomy, hormony oraz fibrynogen. Fibrynogen (F) jest makrocząsteczką posiadającą właściwości kumulacji w nowotworach. Jednocześnie stanowi on normalny składnik macierzy pozakomórkowej i płynów ustrojowych. Cechy te skłaniają do prób wy­korzystania fibrynogenu jako potencjalnie użytecznego nośnika leku przeciw­nowotworowego, najczęściej stosowanego w formie koniugatu. Jednym z leków stosowanych w takiej formie jest metotreksat (MTX). Celem naszej pracy było zbadanie aktywności cytotoksycznej in vitro i przeciwnowotworowej in vivo koniugatu MTX z fibrynogenem o spodziewanej zwiększonej aktywności przeciw­nowotworowej i obniżonej toksyczności w porównaniu z MTX. Aktywność cytotoksyczną in vitro badano w teście SRB wobec komórek czterech linii ludzkich nowotworów pochodzących z różnych narządów: A594 – rak płuc, HU1703 – rak pęcherza moczowego, EBWWez – rak okrężnicy, SW707 – rak odbytnicy.

          W badaniach in vivo stosowano myszy CDF1, samce w wieku 18–24 tyg. o masie ciała 25–30 g. Model nowotworowy stanowiły komórki białaczki P388 przeszczepiane dootrzewnowo w liczbie 10⁶ komórek, w objętości 0,2 ml/mysz. MTX oraz F-MTX podawano dootrzewnowo w dawkach od 1 do 200 mg/kg, dwukrotnie w dniach 1 i 5 po przeszczepie nowotworu. Efekt przeciwnowotworowy oceniano na podstawie pomiaru ILS (increase in life span) – wyrażonego w procentach przedłużenia czasu przeżycia myszy leczonych w porównaniu z kontrolą.

          W przeprowadzonych testach in vitro wykazano statystycznie istotnie obniżoną cytotoksyczność preparatu F-MTX w porównaniu z samym MTX. W badaniach in vivo stwierdzono istotne przedłużenie czasu życia zwierząt obarczonych nowo­tworem po leczeniu preparatem F-MTX (24 dni) w porównaniu z odpowiadającą dawką MTX, tj. 24 mg/kg, podanego w dniach 1 i 5 (18 dni). Na podstawie wyników badań in vitro i in vivo uzasadnione wydaje się stosowanie fibrynogenu jako nośnika cytostatyku w formie koniugatu. Jego niższa toksyczność in vitro przy wyższej aktyw­ności przeciwnowotworowej może być tłumaczona efektem wykrzepiania się fibryny.

Terapia elektrochemiczna

Badania dotyczące terapii elektrochemicznej przeprowadzono we współpracy z drem Maciejem Wójcickim z AM w Szczecinie. Badania te przeprowadzono na myszach obarczonych przeszczepialnym rakiem sutka 16/C lub mysim włókniako­mięsakiem F69-3. Wykazano skuteczność terapii elektrochemicznej (stosowano prąd o następujących parametrach: 6–7 V, 5–21 mA).

          Wyniki badań były prezentowane w formie komunikatów na: XV Polskim Sympozjum Peptydowym w Waplewie k/Olsztyna; Multidyscyplinarnej Konferencji Nauki o Leku w Muszynie; 7^th International Symposium on Molecular Aspects of Chemotherapy w Gdańsku; Italian-Hungarian-Polish Joint Meeting on Medicinal Chemistry, Giardini Naxos, Italy; I Krajowym Kongresie Biotechnologii we Wrocławiu.

Wykonawcy: dr A. Opolski i lek. wet. J. Wietrzyk, dr J. Boratyński
Publikacje nr: 48, 49, 109, 124 i 125

Temat nr 5

Wpływ poziomu GABA (kwas g-aminomasłowy) i aktywności GAD (dekarbo­sylaza kwasu glutaminowego) na wzrost nowotworu z zastosowaniem modelu raka sutka 16/C u myszy szczepu C3H

Laboratorium Immunologii Nowotworów, kierownik: prof. dr Czesław Radzikowski

Przeprowadzone przez nas w okresie sprawozdawczym badania wykazują obec­ność GABA (kwas g-aminomasłowy) i aktywność GAD (dekarbosylaza kwasu glu­taminowego) zarówno w tkance nowotworu, jak i w tkance otaczającej nowotwór u kobiet. Ponadto, stwierdziliśmy istotne podwyższenie poziomu GABA i aktywności GAD w tkance nowotworowej w porównaniu z tkanką otaczającą guz oraz tkanką prawidłową. Wyniki naszych badań u zwierząt wskazują również na wyższą zawartość tych czynników w raku sutka u myszy w porównaniu z sutkiem niezmienionym lub pochodzącym od myszy zdrowych.

Ponadto porównaliśmy zawartość GABA i aktywność GAD w tkance prawid­łowej gruczołu piersiowego z „łagodnymi” zmianami nowotworowymi oraz rakiem piersi u kobiet. Poziom GABA i aktywność GAD były wyższe w tkankach gruczołu piersiowego kobiet chorych na raka piersi w porównaniu z wartościami u kobiet z „łagodnymi” zmianami nowotworowymi. Przeprowadziliśmy także badania nad wpływem baklofenu – agonisty układu GABA-ergicznego na rozwój raka sutka 16/C u myszy C3H, a także oznaczyliśmy zawartość GABA i aktywność GAD zarówno w tkance nowotworowej jak i tkance gruczołu sutkowego myszy obarczonych rakiem sutka 16/C leczonych baklofenem i myszy kontrolnych. Wykazano wyższy poziom GABA i aktywność GAD w raku sutka 16/C i niezmienionym gruczole sutkowym u myszy leczonych baklofenem w porównaniu do myszy kontrolnych. Stwierdzono także dodatnią korelację między poziomem GABA a aktywnością GAD w obu badanych grupach. Ponadto baklofen w stopniu istotnym statystycznie hamował wzrost raka sutka 16/C u myszy.

          Wyniki badań były prezentowane na XXXV Zjeździe Polskiego Towarzystwa Biochemicznego w Olsztynie i na 7^th International Symposium on Molecular Aspects of Chemotherapy w Gdańsku.

Wykonawcy: dr A. Opolski i lek. wet. J. Wietrzyk

Publikacje nr: 43 i 44

Temat nr 6

Badania modelowe nad optymalizacją strategii złożonej chemioimmunoterapii przeciwnowotworowej u myszy z przeszczepialnym rakiem jelita grubego

Laboratorium Immunologii Nowotworów, kierownik: prof. dr Czesław Radzikowski

          Na modelu mysiego raka okrężnicy C38 przeprowadzono doświadczenia pro­wadzące do optymalizacji protokołu terapeutycznego kombinowanej chemioimmuno­terapii, polegającej na podaniu cytostatyku z następowym lokalnym (okołoguzowym) stosowaniem cytokiny wytwarzanej przez komórki szpiczaka transfekowane genem mIL-2 (X63mIL-2). Porównano działanie dwóch cytostatyków oksazafosforynowych – cyklofosfamidu (CY) i preparatu CBM-11, tj. optycznie czynnego izomeru S(-) bromofosfamidu, o wysokiej aktywności przeciwnowo­tworowej. Wdrożenie leczenia preparatami (dla celów porównawczych zastosowano dawki ekwitoksyczne CY i CBM-11) rozpoczynano u myszy B6D2F1 z zaawansowanymi guzami raka okrężnicy C38, tj. po ok. 2 tygodniach od podskórnego wszczepienia nowotworu. Po ok. 10–12 dniach podawano drugą dawkę cytostatyku. Porównanie działania hamującego wzrost guzów po podaniu wyłącznie cytostatyku wskazuje na silniejszy efekt przeciw­nowotworowy preparatu CBM-11, gdyż po dwukrotnym podaniu tego preparatu zaobserwowano całkowite regresje nowotworów (20%).

          W wyniku włączenia do terapii komórek produkujących IL-2 obserwowano znaczące zwiększenie działania hamującego wzrost guzów, co prowadziło do uzys­kania znacznej liczby wyleczeń: do 80% po CBM-11 + X63mIL-2 i 55% po kombi­nacji X63mIL-2 z CY.

W ramach współpracy z Zakładem Biochemii, Biologii Komórki i Histologii Wydziału Weterynarii Uniwersytetu w Utrechcie przeprowadzono dwa doświadczenia terapeutyczne na modelu raka okrężnicy, w których zamiast komórek transfekowanych genem IL-2 zastosowano rekombinowaną ludzką IL-2 (Proleukin) w jednorazowej wysokiej dawce 4,5 x 10⁶ U/mysz. W jednym z doświadczeń podano samą IL-2 w dniu 10 po wszczepieniu nowotworu, w drugim zaś IL-2 zastosowano po dwóch dawkach cytostatyku. Podanie wyłącznie proleukiny w dniu 10 myszom z guzami o masie 50–120 mg spowodowało zmniejszenie tempa wzrostu guzów w stosunku do kontroli (Tumor Growth Delay, TGD, ok. 13 dni) i przedłużenie czasu przeżycia o 20% (statystycznie istotna różnica w średnim czasie przeżycia). W wyniku zastosowania proleukiny po dwukrotnym podaniu preparatu CBM-11 obserwowano znaczące przedłużenie czasu przeżycia myszy (ILS – 96%). Średni czas życia myszy był dłuższy w porównaniu do grupy leczonej samym cytostatykiem (różnica statystycznie znamienna, p=0,04). Podobny efekt terapeutyczny obserwowano po podaniu Proleukiny myszom leczonym dwiema dawkami cyklofosfamidu.

Wykonawcy: dr H. Glazman-Kuśnierczyk i dr E. Pajtasz-Piasecka

Publikacja nr 32

Temat nr 7

Badanie związku pomiędzy obecnością antygenów towarzyszących nowotworom (TAA) a potencjałem proliferacyjnym wybranych ludzkich nowotworów: raka piersi i jelita grubego (kontynuacja)

Laboratorium Oddziaływań Międzykomórkowych, kierownik: doc. dr Danuta Duś

Plan badań zakładał:

1.     Porównawczą ocenę ekspresji antygenów związanych z nowotworami: Tn, sjalo Tn, TF, na wariantowych komórkach linii ludzkiego raka jelita grubego, dających zróżnicowaną lokalizację przerzutów doświadczalnych.

2.     Badanie ekspresji receptora Fas i jego liganda – FasL na materiale operacyjnym ludzkiego raka piersi

Ad. 1.

          Antygeny TF (Thomsena-Freidenreicha) i Tn zaliczane są do grupy antygenów nowotworowych (ang. tumor associated antigens, TAA). Zaburzenia na szlakach glikozylacji w komórkach nowotworowych powodują ekspozycję antygenów TF i Tn występujących w normalnych komórkach w formie kryptycznej, oraz uruchomienie szlaku syntezy neoantygenu sjaloTn. W ludzkim raku jelita grubego, ekspresja antygenu TF nie podstawionego kwasem sjalowym oraz antygenu sjaloTn są związane z niepomyślnym rokowaniem przebiegu choroby.

          Przedmiotem naszych badań była porównawcza analiza profilu ekspresji anty­genów TF i Tn w wariantowych komórkach raka jelita grubego, dających zróżni­cowaną lokalizację przerzutów doświadczalnych. Celem badań była odpowiedź na pytanie, czy ekspresja tych antygenów ma związek ze zdolnością komórek nowo­tworowych do zasiedlania określonej tkanki i powstawaniem przerzutów. Stosując uzyskane w Zakładzie Immunologii Nowotworów mysie przeciwciała monoklonalne anty-TF i anty-Tn, porównano stopień ekspresji tych antygenów na selekcjonowanych in vitro i in vivo komórkach wariantowych linii ludzkiego raka jelita grubego LS-180, dających u myszy bezgrasiczych przerzuty eksperymentalne, o zróżnicowanej lokalizacji.

          Stwierdzono, że selekcja in vitro komórek raka jelita pod kątem powinowactwa do komórek śródbłonka naczyniowego nie ma istotnego wpływu na poziom ekspresji antygenów TF i Tn. Natomiast w wariantowych komórkach raka jelita uzyskanych na drodze kilkuetapowej selekcji in vivo, przerzutujących preferencyjnie do wątroby, zarówno po podaniu dośledzionowym jak i ortotopowym (dojelitowym), stwierdzono istotny wzrost poziomu ekspresji antygenu TF, przy stałej, niskiej ekspresji antygenu Tn. W przypadku komórek wariantowych dających przerzuty zlokalizowane w obwodowych węzłach chłonnych, ekspresja antygenu TF, w porównaniu z komórkami linii macierzystej, nie uległa zmianie. Ponieważ nie dysponowaliśmy przeciwciałem anty-sjalo Tn, wykrywaliśmy obecność tego antygenu pośrednio – mierząc poziom wiązania przeciwciała anty-Tn przed i po odsjalowaniu badanych komórek. I w tym przypadku stwierdziliśmy istotny wzrost wiązania tego przeciwciała do odsjalowanych komórek wariantowych dających przerzuty do wątroby, czego nie zaobserwowano w przypadku wariantu lokalizującego się w węzłach chłonnych. Można postulować, że selekcja raka okrężnicy w kierunku komórek dających przerzuty o lokalizacji wątrobo­wej preferuje komórki o wysokiej ekspresji antygenów TF i sjalo Tn. Wariantowe komórki raka jelita o znanym wzorze glikozylacyjnym zostaną zastosowane do badań nad oddziaływaniami adhezyjnymi z komórkami śródbłonków naczyniowych, w poszukiwaniu wyznaczników tkankowej swoistości lokalizacji przerzutów nowo­tworowych.

Ad. 2.

W ciągu roku sprawozdawczego zgromadzono materiał operacyjny z raka piersi od 140 pacjentek z guzem nowotworowym w II stopniu zaawansowania. Przechowywane w -80°C próbki służą do przygotowania skrawków mrożonych, w których, metodą immunohistochemiczną oznaczane są antygeny Fas i FasL oraz, dodatkowo inne markery progresywnego wzrostu nowotworu:  receptory hormonów sterydowych ER i PR, jak również ploidia DNA. Oznaczanie ww. markerów w zebranym materiale, jest na etapie końcowym. Obecnie prowadzimy oznaczenia kontrolne na materiale z guzów łagodnych (20 przypadków). Po zakończeniu badań wyniki oznaczeń poddane zostaną analizie statystycznej a następnie przygotowane do publikacji. Celem badań jest ocena wartości prognostycznej nadekspresji antygenów Fas i FasL w komórkach raka piersi. Hipotetycznie, założyć można, że nadekspresja FasL w komórkach guza może upośledzać efektorową fazę odporności komórkowej gospodarza, poprzez indukcję apoptozy w naciekających guz komórkach cytotoksycznych, ułatwiając tym samym progresję nowotworu. Z kolei, obecność funkcjonalnego antygenu Fas mogłaby ułatwiać zabijanie komórek nowotworowych przez aktywowane komórki cyto­toksyczne układu odpornościowego.

          W ramach badań pilotowych, podjętych wspólnie z doc. T. Kręcickim z Kliniki Otolaryngologii AM we Wrocławiu, w grupie 47 pacjentów z rakiem krtani oznaczono ekspresję białka nm23 oraz p53. Obydwa białka są produktami genów o aktywności przeciwdziałającej wzrostowi nowotworu. Gen NME, którego produktem jest białko nm23, został opisany jako jeden z pierwszych genów „przeciwprzerzutowych”. Dzikie białko p53 jest białkiem regulatorowym proliferacji komórkowej. Zaburzenie jego w ekspresji w komórkach nowotworowych jest często związane z upośledzeniem funkcji przeciwproliferacyjnej. Celem badań była retrospektywna ocena wartości prognostycz­nej oznaczenia białka nm23 w rakach krtani. Analiza wyników wskazuje na zna­mienną statystycznie zależność między poziomem ekspresji tego białka w guzie pierwotnym a obecnością przerzutów.

Wykonawcy: dr A. Krawczenko, lek. med. J. Koźlak, lek. med. D. Sorokin
i mgr E. Wojdat przy współpracy z drem M. Bębenkiem z Dolnośląskiego Centrum Onkologii we Wrocławiu

Temat nr 8

Oddziaływania adhezyjne przerzutujących linii komórek ludzkiego raka jelita grubego z komórkami śródbłonka naczyniowego oraz składowymi macierzy zewnątrzkomórkowej (kontynuacja)

Laboratorium Oddziaływań Międzykomórkowych, kierownik: doc. dr Danuta Duś

          Celem badań były poszukiwania możliwości ograniczenia rozsiewu nowo­tworowego na drodze modulacji adhezyjnych i/lub sygnałowych oddziaływań między­komórkowych, zachodzących między komórkami nowotworowymi a komórkami śród­błonków naczyniowych w miejscu lokalizacji przerzutu nowotworowego. Aktualnie kontynuowana jest charakterystyka funkcjonalna jednego z partnerów stosowanego modelu badawczego: wyprowadzonych i unieśmiertelnionych komórek ośmiu linii ludzkich śródbłonków naczyniowych. W okresie sprawozdawczym zbadano regula­cyjny wpływ IL-7 na aktywność proliferacyjną komórek śródbłonkowych, oraz stwier­dzono obecność receptora dla IL-7 na komórkach niektórych linii śródbłonkowych. Jest to obserwacja oryginalna, gdyż receptor dla IL-7 nie był dotychczas na tych komórkach opisany. Uzyskane wstępne wyniki są obecnie opracowywane do druku. Posłużyły one też za punkt wyjścia do otrzymanego projektu grantowego KBN pt. „Charakterystyka czynnościowa komórek linii śródbłonków naczyniowych: Rola IL-7 oraz jej receptora w oddziaływaniach z komórkami układu odpornościowego”.

Jednym z zadań planowanych w związku z oceną specyficzności oddziaływań adhezyjnych typu białko–cukier, było zastosowanie do badań neoglikoprotein II generacji.

Istotną grupą cząsteczek adhezyjnych, biorących udział w oddziaływaniach międzykomórkowych i przekazywaniu sygnału, są lektyny endogenne. Do badania specyficzności i poziomu ekspresji komórkowych lektyn endogennych metodą cytofluorymetryczną stosowane są znakowane fluorochromami koniugaty białka nośnikowego z odpowiednimi resztami cukrowymi. Do otrzymywania aktywnych czynnościowo koniugatów białko–cukier powszechnie stosowane są chemiczne modyfikacje obu składników reakcji, co może doprowadzić do zmiany konformacji liganda i/lub zmiany jego stałej wiązania z lektyną. Ponadto, jeżeli w skład gliko­koniugatu chcielibyśmy włączyć cukier złożony, np. sjalo Lewis X, modyfikacja chemiczna w trakcie przygotowywania koniugatu doprowadzić może do zmiany jego właściwości antygenowych. Tak więc, poszukiwane są inne sposoby uzyskiwania takich odczynników. Wykonane w roku sprawozdawczym badania dowiodły, że możliwa jest termiczna glikacja białka. Ogrzewając mieszaniny albuminy surowicy wołu z monocukrami (glukoza, fruktoza i N-acetyloglukozamina), w temp. powyżej 100°C, uzyskano odpowiednie koniugaty.

Wykonawcy: dr A. Krawczenko, dr P. Załęcki, dr M. Paprocka, mgr E. Wojdat,
dr J. Boratyński

Publikacje nr: 5, 101 i 105

Temat nr 9

Badania szlaku sygnałowego selekcji pozytywnej prowadzącej do zaniku powierzchniowej ekspresji helikazy RNA/DNA (HEL-T)

Laboratorium Immunologii Komórkowej, kierownik: doc. dr Leon Strządała

Badania zostały przeprowadzone we współpracy z prof. Pawłem Kisielowem z Basel Institut für Immunologie.

          Glikoproteina HEL-T występuje na powierzchni tymocytów przechodzących proces edukacji, tzn. w czasie rearanżacji genów kodujących receptor TCR oraz procesów selekcji pozytywnej i negatywnej. Jej znikanie z powierzchni komórek zwią­zane jest prawdopodobnie z sygnałem selekcji pozytywnej. HEL-T występuje również na powierzchni niektórych klonów komórek chłoniaków grasiczych wywodzących się z niedojrzałych limfocytów T. Komórki te stały się modelem badawczym pozwala­jącym na scharakteryzowanie elementów szlaku sygnałowego doprowadzającego do znikania HEL-T z powierzchni komórek. Nasze poprzednie badania wykazały, że w procesie znikania HEL-T z powierzchni komórek biorą udział klasyczne kinazy białkowe C (cPKC). Celem naszych badań było scharakteryzowanie innych elementów tego szlaku sygnałowego. Chcieliśmy ponadto stwierdzić, czy istnieje podobieństwo pomiędzy omawianym szlakiem sygnałowym a sygnałem selekcji pozytywnej.

W wyniku naszych badań stwierdziliśmy, że:

-        za znikanie HEL-T z powierzchni komórek odpowiedzialne są m.in. cPKC i kalcy­neuryna;

-        szlak sygnałowy regulujący ekspresję HEL-T na powierzchni komórek różni się od szlaków sygnałowych regulujących proces rearanżacji V(D)J brakiem zaangażo­wania kinazy PKA;

-        szlak sygnałowy regulujący ekspresję HEL-T na powierzchni komórek różni się od sygnału selekcji pozytywnej i negatywnej brakiem zaangażowania kinaz MAP;

-        sygnał powodujący zanikanie HEL-T z powierzchni komórek nie jest związany z syntezą białka efektorowego;

-        do odnowienia się puli HEL-T na powierzchni komórek dochodzi po 19 godzinach

-        białko HEL-T jest N-glikozylowane i N-glikozylacja potrzebna jest do jego powierzchniowej ekspresji.

Wykonawcy: mgr M. Cebrat, mgr W. Kałas, dr J. Matuszyk, mgr E. Zioło, J. Czech-Leszczyńska, prof. P. Kisielow

Temat nr 10

Wpływ aktywatorów i inhibitorów kinaz zależnych od cyklicznych nukleotydów (PKA, PKG) na apoptozę chłoniaków grasiczych traktowanych jonomycyną

Laboratorium Immunologii Komórkowej, kierownik: doc. Leon Strządała

          Z linii chłoniaków grasicy myszy z transgenicznym TCR anty-HY/D^b wyizolo­wano klony H3d, H3k i G11, dla których wykazano zróżnicowaną wrażliwość na induktory apoptozy tymocytów: jonomycynę, deksametazon i etopozyd oraz zróżnico­waną ekspresję białek antyapoptotycznych: H3k (bcl-2^-bcl-xl^-), H3d (bcl-2⁺bcl-xl^-), G11 (bcl-2⁺bcl-xl⁺). W ramach poprzednich badań wykazano, że komórki chłoniaków tymocytarnych charakteryzują się opornością na jonomycynę, natomiast do apoptozy prowadzi równoczesne traktowanie jonomycyną i preparatem HA1004, który jest inhibitorem kinaz serynowych. Celem badań było ustalenie wpływu swoistych inhibi­torów oraz aktywatorów kinaz PKA i PKG na apoptozę komórek chłoniaków tymocytar­nych. Apoptozę komórek oceniano ilościowo na podstawie pomiaru zawartości DNA w komórkach utrwalonych etanolem i barwionych jodkiem propidyny. Otrzymane wyniki wskazują na brak istotnego wpływu inhibitorów kinaz serynowych PKA, PKG, CaMK, PKC oraz aktywacji PKG na apoptozę komórek nowotworowych opornych na jonomycynę, natomiast aktywatory PKA (analogi cAMP: cAMP-Sp, Bt2-cAMP) prowadziły do zwiększenia apoptozy komórek traktowanych jonomycyną. Komórki klonu H3k odznaczają się zarówno większą wrażliwością na jonomycynę, jak i na Bt2-cAMP, w porównaniu z komórkami klonu H3d. Traktowanie komórek klonów H3d i H3k preparatem HA1004 i jonomycyną prowadziło do ich apoptozy. Aktywacja PKA przez Bt2-cAMP prowadziła do znacznego zwiększenia apoptozy komórek klonu H3d traktowanych jonomycyną i preparatem HA1004, natomiast w znikomym stopniu zwiększała apoptozę podobnie traktowanych komórek klonu H3k. Z kolei, traktowanie preparatem HA1004, czy Bt2-cAMP nie powodowało zwiększenia apoptozy komórek klonu G11 hodowanych w obecności jonomycyny. Aktywacja PKA prowadziła także do zwiększenia apoptozy komórek klonu H3d traktowanych deksametazonem, natomiast nie powodowała zwiększenia apoptozy traktowanych deksametazonem komórek klonu G11. Stwierdzone różnice we wrażliwości komórek klonów H3k, H3d i G11 na induktory apoptozy mogą być spowodowane przez różnice w ekspresji genu bcl-2 i bcl-xl. Wyniki te wskazują także na zróżnicowane możliwości pozytywnej regulacji apoptozy przez kinazę aktywowaną cAMP oraz negatywnej regulacji przez enzym hamowany przez HA1004 w komórkach chłoniaków tymocytarnych trakto­wanych jonomycyną.

Wykonawcy: dr J. Matuszyk, mgr W. Kałas, mgr E. Zioło, J. Leszczyńska-Czech,
dr M. Kobzdej

Zakład Terapii Doświadczalnej

Temat nr 11

Badania nad minidomeną białka P-53 oddziałującą z DNA

Laboratorium Immunobiologii, kierownik: prof. dr Michał Zimecki

          Białko p53 to znany produkt genu supresorowego komórek powodujący zahamowanie cyklu komórkowego w fazie G₁. Wcześniej stwierdziliśmy, że sekwen­cja aminokwasowa domeny białka p53 oddziałującej z DNA wykazuje homologię z hormonem grasicy, tymopoetyną. Badania syntetycznych fragmentów oktapepty­dowych tej domeny białka p53, tak produktu genu dzikiego, jak i genów zmutowanych, jakie występują w różnych typach nowotworów, wykazały, że: 1) fragmenty te posiadają aktywność immunotropową; 2) właściwości te ulegają zmianom w przypadku frag­mentów białek wariantowych. Najciekawszy wynik otrzymano dla oktapeptydu Gly--Met-Asn-Arg-Ser-Pro-Ile-Leu (fragment białka zmutowanego), który okazał się silnym stymulatorem humoralnej odpowiedzi immunologicznej, natomiast hamował odpowiedź komórkową i silnie indukował produkcję TNF-a. Aktualnie poddano podobnym badaniom przedłużone fragmenty dzikiego białka p53 i jego zmutowanych postaci, w celu sprawdzenia, czy posiadają podobne immunomodulatorowe właś­ciwości jak fragmenty oktapeptydowe. Wiadomo bowiem, że na aktywność tymo­poetyny i białka p53 mają wpływ regiony sąsiednie i porównywalne części N--końcowe. W tym celu zbadano następujące peptydy:

Asn-Ser-Ser-Cys(Acm^x)-Met-Gly-Gly-Met-Asn-Arg-Arg-Pro-Ile-Leu-Thr-Ile-Ile-Thr-Leu-Glu

                                                           20 peptyd                            (forma dzika)

Cys(Acm^x)-Met-Gly-Gly-Met-Asn-Arg-Ser-Pro-Ile-Leu-Thr-Ile-Ile-Thr-Leu-Glu

                                                           17 peptyd                            (forma zmutowana)

Tyr-Met-Cys(Acm)-Asn-Ser-Ser-Cys(Acm)-Met-Gly-Gly-Met-Asn-Arg-Ser-Pro-Ile-Leu-Thr-Ile-Ile-Thr-Leu-Glu

                                               23 peptyd                         (forma zmutowana)

^x/ (Acm) - grupa acetoaminometylowa ochraniająca grupę tiolową cysteiny

          Okazało się, że przedłużenie łańcucha zmienia właściwości immunotropowe fragmentów białka p53. Fragment białka pochodzącego ze szczepu dzikiego był nieaktywny w testach określających odpowiedź immunologiczną zarówno humoralną jak i komórkową (PFC i DTH), zaś przedłużone fragmenty białka pochodzącego ze szczepu zmutowanego były immunosupresorami w obu testach. Pochodzący z tego samego szczepu (badany wcześniej) oktapeptyd Gly-Met-Asn-Arg-Ser-Pro-Ile-Leu stymulował humoralną odpowiedź immunologiczną i produkcję TNFa, zaś hamował odpowiedź komórkową.

          Badanie wykazało więc, że aktywności immunotropowe fragmentów białka p53 zależą od długości łańcucha peptydowego. Właściwości immunotropowe wykazuje wyłącznie białko zmienione w następstwie mutacji genu. Uogólniając sugerujemy, że towarzyszące nowotworom mutacje genu kodującego p53, prowadzące do białek nie oddziaływujących z DNA (co powoduje brak czynnika regulującego wzrost komórek) dają produkty, których fragmenty wykazują aktywności immunotropowe zależne od wielkości (długości) peptydu.

Wykonawcy: prof. dr Z. Wieczorek, przy współpracy z prof. drem I. Siemionem
i dr I. Strug – Wydział Chemii UniwersytetuWrocławskiego

Publikacja  nr 60

Temat nr 12

Badania dwucentrowych inhibitorów receptora interleukiny 1 (IL-1Ra)

Laboratorium Immunobiologii, kierownik: prof. dr Michał Zimecki

          W trakcie badań nad immunomodulatorowymi właściwościami fragmentów białek rodziny interleukiny 1 (IL-1) stwierdziliśmy, że dwa peptydy, A: H-Ile-Thr-Gly-Ser-Glu-OH (fragment 102-106 IL-1a) oraz B: H-Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Lys-OH (fragment 143-148 antagonisty IL-1) są skutecznymi inhibitorami oddziaływania IL-1 z receptorem oraz hamują odpowiedź immunologiczną. Aktywny był także analog peptydu B, zawierający resztę kwasu asparaginowego zamiast lizyny.

          Podjęliśmy próbę zbadania, czy połączenie peptydów A i B doprowadzi do związku o zwiększonej aktywności oraz w jaki sposób charakter tego połączenia wpłynie na właściwości strukturalne i biologiczne otrzymanych peptydów. W tym celu otrzymaliśmy następujące peptydy, różniące się zarówno długością, jak i stopniem usztywnienia połączenia, a także zawierające dodatkowe grupy karboksylowe i aminowe:

I                   H-Ile-Thr-Gly-Ser-Glu-Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Lys-OH

II                  H-Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Lys-Ile-Thr-Gly-Ser-Glu-OH

III -VI           H-Ile-Thr-Gly-Ser-Glu-(Gly)n-Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Lys-OH   n=1 - 4

VII               H-Ile-Thr-Gly-Ser-Glu-Pro-Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Lys-OH

VIII              H-Ile-Thr-Gly-Ser-Glu-D-Pro-Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Lys-OH

IX                H-Ile-Thr-Gly-Ser-Glu-Glu(Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Lys-OH)-OH

X                 H-Ile-Thr-Gly-Ser-Glu-Glu-Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Lys-OH

XI                H-Lys(H-Ile-Thr-Gly-Ser-Glu)-Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Lys-OH

XII               H-Ile-Thr-Gly-Ser-Glu-Lys-Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Lys-OH

XIII              H-Ile-Thr-Gly-Ser-Glu-bAla-Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Lys-OH

XIV              H-Ile-Thr-Gly-Ser-Glu-gAbu-Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Lys-OH

XV               H-Ile-Thr-Gly-Ser-Glu-eAhx-Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Lys-OH

          Peptydy otrzymywane były według procedury Boc na nośniku stałym i po odblokowaniu i oddzieleniu od nośnika oczyszczane były metodami chromatogra­ficznymi. Końcowe produkty wykazywały zadowalającą rozpuszczalność w wodzie.

          Przeprowadzone badania biologiczne dotyczyły zdolności tych peptydów do konkurowania z IL-1 o receptor oraz ich wpływu na odpowiedź immunologiczną typu humoralnego. Badania konkurencji między peptydami i IL-1 przeprowadzono in vitro, z użyciem linii komórkowej LBRM-33-1A5 (komórki chłoniaka myszy B10.BR), która posiada receptory dla IL-1 i pod wpływem IL-1 wytwarza IL-2. Wprowadzenie do hodowli peptydów konkurujących z IL-1 powoduje zmniejszenie wytwarzania IL-2, co znajduje odbicie w słabszym wzroście linii komórkowej (CTLL-2, mysie limfocyty T) zależnej od IL-2. Wpływ peptydów na odpowiedź immunologiczną typu humoralnego badano in vitro określając liczbę komórek produkujących przeciwciała (PFC) według procedury Jernego.

          W teście konkurencji wyraźne działanie inhibitorowe wykazał peptyd IX, zawierający jako łącznik resztę kwasu glutaminowego, wiązanie peptydowe tworzy grupa g-karboksylowa. Wynik ten jest interesujący z uwagi na to, że peptyd IX jako jedyny z całej serii znacząco (do 90%) hamował produkcję IL-2 zależną od IL-1 i efekt ten nie zmieniał się po dwudziestokrotnym zwiększeniu dawki IL-1. Poza tym, porównanie aktywności peptydu IX z peptydem X (także dodatkowa reszta kwasu glutaminowego, ale połączona wiązaniem peptydowym poprzez grupę a-karbo­ksylową) i peptydem XIV zawierającym resztę kwasu g-aminomasłowego (ta sama długość łącznika, ale bez dodatkowej grupy karboksylowej) wskazuje na szczególne właściwości podanego powyżej łącznika w prawdopodobnym oddziaływaniu z receptorem. W przeciwieństwie do badanych heksapeptydów (B i jego analog z Asp zamiast Lys), w których zmiana typu grupy funkcyjnej nie wpływała na aktywność peptydów, w tym przypadku zaznacza się wyraźna preferencja peptydu IX (peptydy XII i XIII z dodatkowymi grupami aminowymi były nieaktywne).

          Właściwości immunosupresorowe wykazywało kilka peptydów, najsilniejsze prezentował peptyd VIII (połączenie przez resztę D-proliny), jednak jego działanie zmniejszało liczbę komórek produkujących przeciwciała jedynie do ok. 30 % wartości kontroli. Peptydy IX i XIV były bardziej skuteczne niż ich analog X.

          Różnice w zachowaniu badanych peptydów w oddziaływaniach IL-1 z recep­torem i badanej odpowiedzi immunologicznej wskazują na złożony proces wywoły­wania reakcji odpornościowej.

          Wyniki zaprezentowano na XV Polskim Sympozjum Peptydowym w Waplewie.

Wykonawca: prof. dr Z. Wieczorek przy współpracy z prof. drem I. Siemionem
i dr A. Kluczyk – Wydział Chemii Uniwersytetu Wrocławskiego

Temat nr 13

Badanie immunotropowych właściwości pochodnych izoksazolu

Laboratorium Immunobiologii, kierownik: prof. dr Michał Zimecki

          Związki posiadające podstawową strukturę izoksazolu znajdują się wśród wielu leków. Celem badań było określenie właściwości immunotropowych szeregu pochod­nych izoksazolu (10 związków). Badano in vivo odpowiedź immunologiczną humoralną i komórkową na erytrocyty barana u myszy, oraz in vitro wpływ związków na proliferację splenocytów mysich indukowaną Konkanawaliną A (ConA) i lipo­polisacharydem oraz wpływ na produkcję immunoglobulin przez stymulowane mitogenem ze szkarłatki (PWM) jednojądrzaste komórki z krwi obwodowej człowieka.

          Związki przekazane do badań na aktywność immunomodulującą oznaczono w zależności od wprowadzonego podstawnika następującymi numerami.

W zestawieniu brakuje związku 8, który w odróżnieniu od wszystkich pozostałych ma strukturę 5-amino-3-metyloizoksazolo[5,4-d]6,7-dihydropirymidyny.

          Z analizy uzyskanych wyników można wyciągnąć następujące wnioski: Związki podstawione pierścieniami aromatycznymi są aktywne, przy czym ich oddziaływanie biologiczne zmniejsza się po przyłączeniu do układu aromatycznego atomu chloru. Najaktywniejszy w tej grupie jest związek 10, który jest podstawiony wyłącznie pierścieniem aromatycznym. Izomery 2-chloro (związek 2) i 3-chloro (związek 9) oraz 4-hydroksy (związek 1) są mniej aktywne. Wyjątkiem jest 4-chloro-podstawiona pochodna (związek 3), która w stężeniu 5 mg/ml niezwykle silnie hamuje proliferację mysich splenocytów indukowaną przez ConA. Związek 5 podstawiony dwiema grupami metylowymi wykazuje najwyższą aktywność. Przejawia się to w silnym hamowaniu odpowiedzi humoralnej u myszy in vivo i u człowieka in vitro. Interesujące właściwości biologiczne posiada połączenie 4, w którym są dwa pod­stawniki z najaktywniejszych związków ( 5 i 10).W związku tym obserwujemy zmianę oddziaływania z supresyjnego związków 5 i 10 na stymulujące. Podstawniki cyklo­alkilowe: cykloheksylowy (związek 6) i decylowy (związek 8) nie powodowały spektakularnego efektu biologicznego. W wyniku reakcji hydrazydu kwasu 5-amino-3-metyloizoksazolo-4-karboksylowego z aldehydem mrówkowym otrzymano związek 7, który ma budowę bicykliczną i wykazuje aktywność biologiczną

Wykonawcy: dr I. Kochanowska, inż. Z. Sonnenberg, H. Polikowska, A. Donigiewicz, K. Nawrocka, mgr K. Spiegel, Z. Bartoszewicz

Temat nr 14

Kostymulujące działanie laktoferyny w generacji odpowiedzi typu komórkowego u myszy

Laboratorium Immunobiologii, kierownik: prof. dr Michał Zimecki

          Laktoferyna (LF) to jedno z ważniejszych białek ochronnych, syntetyzowane i zawarte w neutrofilach oraz w płynach wydzielniczych. Postuluje się, że LF odgrywa zasadniczą rolę w utrzymywaniu homeostazy w czasie wstrząsu pooperacyjnego, septycznego, lub urazu. W opisywanych badaniach wykazaliśmy, że laktoferyna bydlęca (BLF) zwiększała u myszy CBA reakcję nadwrażliwości typu późnego (DTH) na trzy antygeny (SRBC, BCG i ovoalbumina). BLF podawano myszom doustnie, dootrzewnowo lub podawano śródskórnie z dawką uczulającą antygenu w emulsji z niepełnym adiuwantem Freunda (iFa). Reakcję DTH wywoływano 4 dni po immu­nizacji przez podanie wyzwalającej dawki antygenu, a natężenie reakcji mierzono 24 godziny później jako obrzmienie łapy. BLF podwyższała reakcję DTH w stosunku do wszystkich badanych antygenów w sposób zależny od dawki. Podanie BLF przy immunizacji z iFa indukowało podobny poziom DTH jak immunizacja kontrolna w pełnym adiuwancie Freunda (cFa). Wynika z tego, że BLF zastępuje składnik kostymulujący zawarty w cFa. Dodatkowo BLF znacznie podwyższała reakcję DTH na bardzo małą nieimmunogenną dawkę SRBC. Wzrost odpowiedzi DTH był słabszy przy podaniu BLF doustnie, jednakże dla wszystkich dróg podania preparatu BLF wzrost ten był znamienny statystycznie. Biorąc pod uwagę uzyskane wyniki przyjmu­jemy, że laktoferyna może być użyteczna w opracowaniu nowych, bezpieczniejszych i bardziej efektywnych protokołów immunizacyjnych.

Wykonawcy: dr I. Kochanowska, inż. Z. Sonnenberg, H. Polikowska, A. Donigiewicz, K. Nawrocka, mgr K. Spiegel, Z. Bartoszewicz

Temat nr 15

Wpływ PRP na zmianę ekspresji receptora dla PNA na ludzkich tymocytach

Laboratorium Immunofarmakologii, kierownik: doc. dr hab. Stanisław Szymaniec

          Od ponad 20 lat wiadomo, że lektyna z orzeszków ziemnych (peanut agglutinin – PNA) pozwala na rozróżnienie dojrzałych i niedojrzałych tymocytów myszy. Lektyna wiąże się ze strukturą Galb(1®3)GalNAc obecną na powierzchni wielu komórek m.in.: tymocytów. Z tymocytami PNA może łączyć się poprzez CD8a. PNA posiada również zdolność wiązania się z sekwencją Galb(1®4)GlcNAc obecną na powierzchni komórek. Obecność receptorów dla PNA na powierzchni komórek regulowana jest przez glikozylotransferazy.

          W ramach badań nad wpływem PRP na proces różnicowania i dojrzewania komórek zbadano wiązanie się PNA do ludzkich tymocytów. Badania przepro­wadzono na tymocytach pochodzących z grasic usuwanych podczas zabiegów kardio­chirurgicznych u dorosłych pacjentów z Kliniki Kardiochirurgii AM we Wrocławiu. Oceniano odsetek komórek wiążących PNA znakowaną FITC. Badane dwa preparaty PNA w podobnym stopniu wiązały się z komórkami. Obserwowaliśmy, że PNA powoduje w większym stopniu aglutynację tymocytów niż limfocytów pochodzących od tego samego pacjenta. W stężeniach subaglutynacyjnych PNA-FITC nie wiązała się do komórek (brak fluorescencji). W stężeniach wyższych PNA powodowała aglutynację uniemożliwiającą zbadanie komórek w cytofluorymetrze przepływowym. W mikroskopie fluorescencyjnym stwierdzano od 18% do 52% tymocytów PNA⁺. W aglutynatach komórek PNA pozytywnych znajdowały się również komórki nie wyka­zujące świecenia, tzn. PNA negatywne. Podjęte różne próby uzyskania niezagrego­wanych komórek nie zostały zakończone powodzeniem.

Wykonawcy: lek. med. W. Fortuna, lek. med. R. Międzybrodzki, mgr B. Bubak, W. Kilian

Temat nr 16

Korelacja między zwiększonym gromadzeniem w narządach podanych komórek a aktywacją układu krzepnięcia u myszy po podaniu endotoksyn

Laboratorium Immunofarmakologii, kierownik: doc. dr hab. Stanisław Szymaniec

          Wstrząs septyczny jest najczęstszą przyczyną zgonów na oddziałach inten­sywnej opieki medycznej. Wstrząs może pojawić się jako powikłanie ciężkich zabie­gów operacyjnych, oparzeń, białaczki, cukrzycy, terapii lekami immunosupresyjnymi, wyniszczenia, zapalenia otrzewnej, infekcji dróg moczowych. Kluczową rolę w patogenezie wstrząsu septycznego odgrywają endotoksyny (lipopolisacharydy - LPS) będące składnikami ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych.

          Celem przeprowadzonych badań było wyjaśnienie udziału układu krzepnięcia i fibrynolizy w złożonym mechanizmie zwiększonego gromadzenia komórek w na­rządach obserwowanego po podaniu LPS. Zjawisko to występuje m.in. we wstrząsie septycznym, w którym gromadzące się w płucach neutrofile uwalniają szereg mediatorów i powodują uszkodzenie śródbłonka naczyń płuc. Wstrząs septyczny jest jednym z głównych czynników prowadzących do powstania zespołu ostrej niewydol­ności oddechowej (Acute Respiratory Distress Syndrome – ARDS). Mechanizm tego zjawiska, jest złożony. Sugerowany jest w nim udział adhezji komórek w drobnych naczyniach tętniczych, zmian cytoszkieletu komórek oraz zaburzeń procesów krzepnięcia. Endotoksyna podana parenteralnie wywołuje u zwierząt zespół objawów podobnych do ARDS.

          W eksperymentach in vivo z podaniem i.v. endotoksyny i znakowanych chromem 51 komórek syngenicznych (limfocyty, tymocyty) stwierdziliśmy statys­tycznie znamienne zwiększone ich gromadzenie w płucach myszy. Zwiększone gromadzenie komórek występowało również w przypadku podania i.v. znakowanych komórek nowotworowych (linie YAC-1 i LL2).

          Do badań układu krzepnięcia i fibrynolizy użyto testu lateksowego D-dimer Assay (ALAB). Obecność D-dimerów fibryny jest markerem toczących się jedno­cześnie procesów krzepnięcia i fibrynolizy krwi. W przeprowadzonych badaniach nie wykryliśmy obecności D-dimerów fibryny w osoczu cytrynianowym pobranym od myszy, którym uprzednio podano i.v. LPS  z Hafnia alvei  981 w dawce 25 mg/mysz (nie obserwowano aglutynacji w teście lateksowym). Badania wykonano w okresie, w którym obserwuje się prawie dwukrotny wzrost gromadzenia w płucach znakowanych ⁵¹Cr komórek YAC-1.

          W eksperymencie, w którym indukowano wstrząs endotoksyczny i oznaczano równocześnie D-dimery, monomery fibryny i płytki krwi również nie wykazano obecności D-dimerów. Stwierdzono natomiast obecność monomerów fibryny i umiar­kowany spadek liczby płytek krwi, co może przemawiać za toczącym się procesem śródnaczyniowego wykrzepiania.

Wykonawcy: lek. med. W. Fortuna, lek. med. R. Międzybrodzki, mgr B. Bubak, W. Kilian

Temat nr 17

Badanie aktywności biologicznej różnych endotoksyn i roli swoistych przeciwciał antylipopolisacharydowych w doświadczalnym zapaleniu gałki ocznej

Laboratorium Immunofarmakologii, kierownik: doc. dr hab. Stanisław Szymaniec

          Procesy zapalne w obrębie wnętrza gałki ocznej należą do jednych z częstych i trudniejszych problemów terapeutycznych. Proces zapalny indukowany w oku przez podanie endotoksyny stanowi dogodny model badań zarówno mechanizmu zapalenia jak i wpływu czynników modulujących.

          LPS już w małej dawce (2,5 ng) podany do przedniej komory oka indukuje proces zapalny. Dawka 5 ng indukuje proces o intensywniejszym nasileniu. Kom­pleksy LPS-Ab (zawierające 5 ng LPS z H. alvei 981D) indukowały proces zapalny w oku o podobnym nasileniu jak 5 ng samego LPS. Również inne kompleksy zawiera­jące LPS z E. coli O14 i przeciwciała indukowały proces zapalny. Działanie kompleksów było miejscowe, ograniczone do oka, do którego wykonano iniekcję.

          Do badań w mikroskopie skaningowym pobrano i utrwalono gałki oczne od zwierząt, które otrzymały LPS lub kompleksy LPS-Ab. Przedmiotem oceny były komórki śródbłonka rogówki i ich interakcja z komórkami wysięku.

          Na podstawie dotychczasowych wyników wydaje się, że przeciwciała przeciw­ko LPS, które mogłyby znajdować się w przedniej komorze oka nie chronią przed indukcją procesu zapalnego wywołanego endotoksyną.

Wykonawcy: lek. med. W. Fortuna, lek. med. R. Międzybrodzki, mgr B. Bubak, W. Kilian

Temat nr 18

Ekspresja receptora zeta kompleksu TCR/CD3 w limfocytach krwi obwodowej u chorych na chłoniaki złośliwe

Laboratorium Immunopatologii, kierownik: prof. dr Irena Frydecka

          U chorych na nieziarnicze chłoniaki złośliwe stwierdza się znaczne zaburzenia funkcji układu odpornościowego. Odpowiedź odpornościową rozpoczyna aktywacja limfocytu, TCR wykazuje pojedynczy typ swoistości i jest odpowiedzialny za rozpoznanie antygenu. Związanej z nim strukturze CD3 przypisuje się kluczową rolę w przekazywaniu sygnału aktywującego do wnętrza komórki. W odróżnieniu od receptora TCR, zakotwiczonego w cytoplazmie tylko krótkim odcinkiem, większość cząsteczki CD3 znajduje się wewnątrz komórki. Ta konfiguracja przestrzenna struktury CD3 umożliwia jej funkcję jako nośnika sygnału aktywującego do wnętrza komórki.

          Cząsteczka CD3 stanowi kompleks składający się z pięciu łańcuchów poli­peptydowych: gamma, delta, epsilon, zeta i eta, zwanych niezmiennymi w odróżnieniu od łańcuchów TCR. Kluczową rolę w przewodzeniu sygnału do wnętrza komórki odgrywa łańcuch zeta. Obecność łańcucha zeta, występującego jako heterodimer związany z CD16, stwierdzono również w komórkach NK. Prawdopodobnie współ­uczestniczy on w indukcji reakcji ADCC, której efektorami mogą być komórki NK.

          Celem badania było określenie ekspresji receptora zeta kompleksu CD3 w poszczególnych subpopulacjach limfocytów T (CD4+, CD8+) oraz komórkach NK (CD56) u chorych na chłoniaki złośliwe nieziarnicze.

          Badania przeprowadzono u 35 chorych na chłoniaki złośliwe nieziarnicze w stadium III i IV zaawansowania klinicznego w wieku 20–63 lat, 20 chorych w aktywnej fazie choroby i 15 w całkowitej remisji klinicznej. Piętnaście zdrowych osób wiekiem i płcią odpowiadających badanym chorym stanowiło grupę kontrolną. Ekspresję łańcucha zeta określano na permeabilizowanych limfocytach CD4+, CD8+ i CD56+ krwi obwodowej, przed i po 72-godzinnej hodowli, metodą podwójnej immuno­fluorescencji w cytofluorymetrze przepływowym (Becton Dickinson, San Jose, Ca). Używano przeciwciał produkcji firmy Coulter, Miami, Fl. Wyniki przedstawiono jako odsetek komórek podwójnie pozytywnych (CD4+zeta+, CD8+zeta+, CD56+zeta+) przed i po 72-godzinnej hodowli kontrolnej, hodowli z dodatkiem 10 ng/ml anty-CD3 oraz hodowli z dodatkiem 10 ng/ml anty-CD3 i 500 IU/ml rIL-2 (Chiron, Holandia).

          U chorych na chłoniaki złośliwe w zaawansowanych stadiach klinicznych wykazano istotnie statystycznie niższy odsetek limfocytów CD4+, CD8+, CD56+ wykazujących koekspresję łańcucha zeta w aktywnej fazie choroby w porównaniu z grupą osób zdrowych. W remisji klinicznej odsetek limfocytów CD4+zeta+, CD8+zeta+ i CD56+zeta+ był wyższy niż u chorych w aktywnej fazie choroby, ale nie osiągał wartości uzyskanych w grupie osób zdrowych. Stymulacja przeciwciałami anty-CD3 nie zwiększała istotnie ekspresji łańcucha zeta w badanych subpopulacjach limfocytów. Kostymulacja rIL-2 zwiększała odsetek komórek CD4+zeta+, CD8+zeta+ i CD56+zeta+ we wszystkich grupach badanych chorych, jednak wartość odsetka limfocytów CD4+zeta+ w aktywnej fazie choroby pozostawała istotnie niższa od analogicznej wartości uzyskanej w grupie osób zdrowych.

          Podsumowując, u chorych na chłoniaki nieziarnicze stwierdza się głębokie zaburzenia ekspresji łańcucha CD3zeta, co może być jednym z mechanizmów prowadzących do upośledzenia odporności u tych chorych.

Wykonawcy: lek. med. D. Boćko, lek. med. A. Kosmaczewska, dr L. Ciszak, A. Tutak i A. Szteblich

Temat nr 19

Badanie stężenia rozpuszczalnych form cząsteczek adhezyjnych w surowicy krwi chorych na ziarnicę złośliwą w różnych fazach choroby

Laboratorium Immunopatologii, kierownik: prof. dr Irena Frydecka

          Badania przeprowadzone u chorych na schorzenia nowotworowe wykazują za­burzenia odporności, głównie w zakresie odporności komórkowej. Specjalne zaintere­sowanie wzbudziła w ostatnich latach możliwość oznaczania w płynach ustrojowych uwalnianych z komórek antygenów różnicowania, zwanych “soluble molecules”, którym przypisuje się dużą rolę w regulacji odpowiedzi odpornościowej. Cząsteczki adhezyjne odgrywają kluczową rolę w reakcjach odpornościowych organizmu, warun­kują między innymi interakcje międzykomórkowe, interakcje komórka–środowisko, migrację komórek, zasiedlanie, wzmagają efektywność prezentacji antygenu. Aktywo­wane komórki mogą w wyniku reakcji proteolitycznej uwalniać z powierzchni ko­mórki domenę pozakomórkową cząsteczek adhezyjnych, której obecność można wykazać w formie rozpuszczalnej w surowicy krwi. Badanie stężenia tych rozpusz­czalnych antygenów może mieć duże znaczenie prognostyczne i może być pomocne w monitorowaniu efektywności leczenia chorych. Rozpuszczalne formy cząsteczek adhezyjnych mogą wiązać się z ich ligandami i w ten sposób hamować reakcje odpor­nościowe ustroju. Dotychczasowe wyniki badań stężenia rozpuszczalnych cząsteczek adhezyjnych w surowicy krwi u chorych na schorzenia nowotworowe nie dostarczyły jednoznacznych wyników. Wykazały one różne stężenia poszczególnych rozpuszczal­nych cząsteczek adhezyjnych w różnych typach nowotworów.

          Celem pracy była ocena stężenia sICAM-1 i s-selektyny E u chorych na ziarnicę złośliwą w odniesieniu do aktywności choroby i wyników leczenia. Badania przeprowadzono u 73 chorych na ziarnicę złośliwą: u 30 chorych w aktywnej fazie w zaawansowanych stadiach choroby, u 28 chorych w okresie całkowitej remisji klinicznej i u 15 chorych we wczesnym okresie wznowy choroby oraz u 15 osób zdrowych, płcią i wiekiem odpowiadających grupie badanych chorych. Rozpuszczalną formę ICAM-1 i selektyny E oznaczano w surowicy krwi za pomocą testu ELISA przy użyciu zestawu odczynników R&D Systems, Albington, UK.

          W badanej przez nas grupie chorych na ziarnicę złośliwą stwierdziliśmy statystycznie istotne niższe stężenie sICAM-1 w surowicy krwi w aktywnej fazie choroby, w porównaniu z grupą chorych w remisji klinicznej i grupą kontrolną oraz grupą chorych w okresie wznowy klinicznej. Średnia wartość stężenia sICAM-1 u chorych w remisji klinicznej i we wczesnej wznowie choroby nie różniła się istotnie od analogicznej wartości uzyskanej u osób zdrowych. Średnie stężenia selektyny E w surowicy krwi chorych na ziarnicę złośliwą w aktywnej fazie choroby i remisji klinicznej a także w okresie wznowy choroby były podobne do wartości uzyskanej u osób zdrowych.

Wykonawcy: lek. med. D. Boćko, lek. med. A. Kosmaczewska, dr L. Ciszak, A. Tutak, A. Szteblich

Zakład Immunochemii

Temat nr 20

Wstępna charakterystyka chemiczna wielocukrów O-swoistych szczepów Hafnia alvei 1217, 1218, 1219 i 1223

Laboratorium Immunochemii Drobnoustrojów i Szczepionek,
kierownik: prof. dr Czesław Ługowski

          Analiza chemiczna wielocukrów O-swoistych otrzymanych z trzech szczepów Hafnia alvei – 1217, 1218 i 1219 pozwoliła stwierdzić, że są one bardzo podobne strukturalnie, lub wręcz identyczne z wcześniej badanymi wielocukrami O-swoistymi (H. alvei 2, 32, ATCC 13337), których struktury zostały opublikowane.

Wyniki analiz cukrowych i metylacyjnych wskazują na to, że wielocukier O-swoisty 1218 ma strukturę wielocukru Hafnia 32, zawiera pentasacharydowe powtarzające się jednostki, zbudowane z galaktozy, kwasu galakturonowego, ram­nozy, galaktozaminy i glukozaminy.

          Wielocukier O-swoisty Hafnia 1219 zbudowany jest z pentasacharydowych podjednostek, w skład których wchodzą 2 galaktozaminy, 1 glukozamina i 2 glukozy. Grupa aminowa glukozaminy podstawiona jest resztą kwasu 3-hydroksymasłowego. Wielocukier ten zawiera wiązanie fosfodwuestrowe i grupy O-acetylowe. Wyniki analiz metylacyjnych przeprowadzonych na defosforylowanych wielocukrach pocho­dzących z lipopolisacharydów H. alvei 1219, 1187 i ATCC 13337 (szczep standardowy) pozwalają przypuszczać, że antygen O Hafnia 1219 ma identyczną strukturę jak antygen O ATCC 13337 i bardzo podobną do antygenu O 1187. Szczep H. alvei 1219 jest już siódmym, badanym w naszym Laboratorium szczepem, należącym do tego samego serotypu i chemotypu.

          Wstępne wyniki analiz cukrowych wielocukru Hafnia 1217 wskazują na istnienie w nim oktasacharydowych podjednostek (Glc:Gal:NeuAc, 4:3:1), w których jednym ze składników jest kwas sjalowy, wykryty do tej pory tylko w dwóch szczepach H. alvei – 2 i 1186. Strukturę wielocukru O-swoistego H. alvei 2 opublikowano wcześniej.

          Dalsze badania chemiczne, spektroskopowe (NMR) i serologiczne pozwolą ostatecznie ustalić, czy badane wielocukry są identyczne, czy też różnią się strukturalnie od wielo­cukrów H. alvei 32, ATCC 13337 i 2.

          Wielocukier O-swoisty H. alvei 1223, na podstawie wyników analiz chemicz­nych i badań NMR, okazał się mannanem o następującej strukturze:

®2aDMan1®2aDMan1®2aDMan1®3aDMan1®3aDMan1®

          Jest to pierwszy szczep H. alvei, w którym znaleziono antygen O zbudowany tylko z jednego cukru; podobne mannany występują natomiast w szczepach E. coli, Klebsiella i Citrobacter.

          Wyniki analizy cukrowej i metylacyjnej oligocukru rdzeniowego H. alvei 1223 przemawiają za jego typową dla rodzaju Hafnia budową.

Wykonawcy: dr E. Katzenellenbogen, prof. dr E. Romanowska

Temat nr 21

Heterogenność lipopolisacharydowych regionów rdzeniowych rodzaju Hafnia.

Badania strukturalne oligocukrów rdzeniowych lipopolisacharydów
H. alvei 1185 i 1204

Laboratorium Immunochemii Drobnoustrojów i Szczepionek,
kierownik: prof. dr Czesław Ługowski

          Wstępna analiza chemiczna oligocukrów rdzeniowych lipopolisacharydów H. alvei 1185 i 1204 wykazała, że zawierają one galaktozę, glukozę i heptozę i różnią się składem chemicznym (obecność galaktozy) od oligocukrów rdzeniowych, wys­tępujących w większości szczepów Hafnia.

          Przeprowadzone w roku sprawozdawczym badania (analiza NMR natywnych i defosforylowanych rdzeni, lokalizacja grup fosforanowych, ustalenie sekwencji i konfiguracji wiązań oraz podstawienia Kdo) pozwoliły zaproponować następującą nową strukturę występującą w rdzeniach lipopolisacharydów H. alvei 1185 i 1204:

                                                           aLDHep

                                                                  —  7

aDGal1®3aDGlc1®3aLDHep1®3aLDHep1®5Kdo

                                                                  ­  4               1 4

                                                                  P          P-P-EtN

          Oligocukier rdzeniowy LPS 1185 i 1204 różni się od tego, który występuje w większości szczepów Hafnia, tylko jednym cukrem, a mianowicie zawiera terminalną galaktozę w miejscu terminalnej glukozy, obecnej w rdzeniu typowym.

          Uzyskane wyniki są oryginalne i zostały opracowane w formie manuskryptu, który po uzupełnieniu wynikami badań NMR, będzie wysłany do druku.

Wykonawcy: dr E. Katzenellenbogen, prof. dr E. Romanowska

Temat nr 22

Swoistość serologiczna i aktywność antylipopolisacharydowa przeciwciał skierowanych przeciwko fragmentowi rdzeniowemu E. coli typu R4

Laboratorium Immunochemii Drobnoustrojów i Szczepionek,
kierownik: prof. dr Czesław Ługowski

          Bakteryjne endotoksyny nazywane ze względu na swoją budowę chemiczną lipopolisacharydami (LPS) są głównymi substancjami odgrywającymi rolę w etiologii szoku septycznego. Uogólnione zakażenia bakteriami Gram-ujemnymi, wśród których przeważają takie gatunki jak E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, oraz szok septyczny są głównymi przyczynami powikłań wśród hospitalizowanych pacjentów. Pomimo wprowadzania do praktyki klinicznej nowych generacji antybio­tyków śmiertelność wśród pacjentów z posocznicą sięga aż 30–60%. Jedną z przyczyn częstej nieskuteczności terapii antybiotykowej jest niezdolność antybiotyków do inaktywowania endotoksyn. Te ograniczenia w terapii zmuszają do poszukiwania ochronnych przeciwciał neutralizujących endotoksyny.

          Lipopolisacharyd (LPS) posiada w swojej strukturze oligocukrowy region rdzeniowy, który charakteryzuje się małą zmiennością i jest eksponowany zarówno przez wolną formę LPS jak i LPS obecny na powierzchni komórek bakteryjnych dzikich szczepów. Dotychczas zidentyfikowano dwa typy rdzenia wśród gładkich (S) szczepów Salmonella, wśród których przeważa typ Ra, oraz zaledwie pięć typów rdzenia w serotypach E.coli (R1, R2, R3, R4, K12).

          Wcześniejsze badania nad swoistością i właściwościami ochronnymi przeciw­ciał skierowanych przeciwko koniugatom oligocukrów rdzeni typu E. coli R1, R2, R3 i Salmonella typu Ra wykazały, że przeciwciała skierowane przeciwko temu kon­serwatywnemu fragmentowi endotoksyny dają krzyżową ochronę wiążąc się z gładkimi lipopolisacharydami związanymi z komórkami bakteryjnymi lub tworzącymi kompleksy z białkami surowicy. Przeciwciała uzyskane w wyniku immunizacji koniu­gatami oligocukrów rdzeni lipopolisacharydów E. coli z toksoidem tężca chronią zwierzęta doświadczalne przed infekcją wywołaną homologicznymi lub pokrewnymi szczepami oraz przed wstrząsem endotoksycznym.

          Wstępne wyniki badań wskazywały, że surowice poliklonalne uzyskane dla rdzenia E. coli typu R4 charakteryzują się wyjątkową zdolnością do reagowania z lipopolisacharydami wielu różnych gatunków bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Wydało się więc celowe szczegółowe zbadanie swoistości przeciwciał antykoniuga­towych, ponieważ istnieje możliwość ich zastosowania do neutralizacji endotoksyn niespokrewnionych serologicznie w obrębie łańcuchów O-swoistych.

          Uzyskany koniugat oligocukru  (OS) rdzenia E. coli typu R4 z toksoidem tężcowym jest silnym immunogenem, indukującym u zwierząt powstawanie swoistych antylipo­polisacharydowych przeciwciał. Przeciwciała antykoniugatowe wykazują wyjątkowo szerokie spektrum reaktywności w porównaniu z opisanymi przez nas wcześniej koniugatami rdzeni typu R1, R2, R3. Surowica anty-OS R4-TT wykazuje silną reakcję z lipopolisacharydami, pochodzącymi zarówno z szorstkich jak i gładkich form bakterii. Najsilniejsze reakcje, zarówno w teście ELISA jak i immunoblotingu, obser­wowano dla endotoksyn posiadających rdzeń typu R4 i R1. Wyraźną, choć nieco słabszą, reakcję uzyskano z LPS o typie rdzenia E. coli  R2, R3, Salmonella Ra, Kl. pneumoniae, Pl. Phigelloides i H. alvei. Badane przeciwciała wykazują aktywność opsonizującą – reagują z żywymi komórkami bakteryjnymi, zwiększając wielokrotnie indeks fagocytarny i odsetek komórek zabijanych przez makrofagi oraz aktywność antylipopolisacharydową.

          Dalsze badania będą dotyczyły głównie antyendotoksynowej i antybakteryjnej aktywności ochronnej przeciwciał anty-OS R4-TT oraz zdolności koniugatu do induk­cji odpowiedzi komórkowej.

          Potwierdzenie wstępnych wyników dotyczących aktywności antyendotoksy­nowej i antybakteryjnej przeciwciał antykoniugatowych wobec szerszej grupy szczepów bakteryjnych i izolowanych z nich lipopolisacharydów stworzy szanse wykorzystania koniugatu jako jednego ze składników szczepionki antybakteryjnej o szerokim spektrum działania.

          Uzyskane wyniki mają zarówno charakter poznawczy jak i praktyczny.

Wykonawcy: dr W. Jachymek, dr T. Niedziela, mgr J. Czaja

Temat nr 23

Kowalencyjne koniugaty oligocukrów rdzenia endotoksyny Bordetella pertussis z białkiem: otrzymywanie, właściwości immunogenne

Laboratorium Immunochemii Drobnoustrojów i Szczepionek,
kierownik: prof. dr Czesław Ługowski

          Krztusiec jest chorobą zakaźną wieku dziecięcego, niebezpieczną dla noworodków i małych dzieci. Czynnikiem etiologicznym krztuśca jest pałeczka Bordetella pertussis. Wytwarza ona znaczną ilość toksyn i substancji toksyno­podobnych, które odgrywają rolę w patogenezie krztuśca, w odpowiedzi gospodarza na zakażenie i w powstawaniu odporności. Do substancji tych należą: toksyna krztuścowa, włókienkowa hemaglutynina, pertaktyna, toksyna dermonekrotyczna, cytotoksyna tchawicza, cyklaza adenylowa i endotoksyna.

          Efektem zakażenia B. pertussis jest selektywne niszczenie urzęsionych komórek nabłonka górnych dróg oddechowych. Wykazano, że bezpośrednim czyn­nikiem wywołującym zmiany cytopatologiczne jest cytotoksyna tchawicza, działająca jednak synergistycznie z endotoksyną, a do uszkodzenia urzęsionych komórek nabłonka dochodzi na drodze indukcji produkcji NO w sąsiadujących z nimi komórkach nie urzęsionych. Wskazuje to, że endotoksyna jest ważnym czynnikiem wirulencji B. pertussis.

          Endotoksyna B. pertusis występuje w formie tzw. lipooligosacharydu (LOS) i chociaż różni się budową od lipopolisacharydów innych bakterii Gram-ujemnych, ma podobne do nich właściwości biologiczne. Powierzchnia komórki bakteryjnej składa się aż w 75% z lipopolisacharydów. Są one głównymi składnikami powierzchni komórki bakteryjnej, a cukrowy fragment LOS B. pertussis jest dobrze wyekspono­wanym antygenem powierzchniowym, łatwo dostępnym dla przeciwciał i stano­wiącym główny cel działania przeciwciał, które mogą wykazywać działanie ochronne w infekcjach B. pertussis. Wykazano, że monoklonalne przeciwciała anty-lipopolisacharydowe chroniły myszy przed śmiertelnym zakażeniem B. pertussis wywołanym podaniem wirulentnych bakterii w aerozolu. Wcześniejsze badania nad koniugatami oligocukrów rdzenia LPS N. meningitidis z toksoidem tężcowym, wykazały, że są one immunogenne, a uzyskane surowice odpornościowe posiadają aktywność bakteriobójczą względem N. meningitidis o identycznym serotypie. Biorąc pod uwagę pewne podobieństwa w budowie LPS N. meningitidis i B. pertussis (brak części O-swoistej) wydaje się celowe skonstruowanie podobnego koniugatu dla LOS B. pertussis.

          Wydaje się istotne poznanie budowy LOS pochodzących z różnych szczepów B. pertusis oraz zbadanie ich immunogenności. Głównym celem pracy było otrzy­manie koniugatów oligosacharydów rdzenia B. pertusis z białkiem, uzyskanie króliczych surowic odpornościowych i ich charakterystyka immunochemiczna.

          Otrzymano szereg preparatów LOS z różnych szczepów B. pertussis, które następnie poddano wstępnej analizie elektroforetycznej. Ze względu na brak danych dotyczących pełnych struktur oligocukrów rdzenia LOS B. pertussis. (nieznany typ wiązań i anomeria składników w obrębie trójcukru na końcu nieredukującym oligo­sacharydu) wykonano szereg analiz chemicznych, z analizą cukrową i metylacyjną. Stosując metody NMR ustalono anomerię wiązań w obrębie dystalnego trójcukru. Wykorzystując reakcję deaminacji LOS wyizolowanego ze szczepu gładkiego (SR) B. pertussis uzyskano pentasacharydowy fragment lipooligosacharydu. Został on następnie wykorzystany do wytworzenia chemicznych koniugatów z toksoidem tężco­wym. Zastosowany typ wiązania oraz użyty nośnik białkowy są powszechnie akcepto­wane w szczepionkach dla ludzi.

          Uzyskano królicze surowice odpornościowe i oznaczono ich swoistość i re­aktywność z LOS dzikich szczepów B. pertussis. Badania serologiczne przepro­wadzono za pomocą testów immunoenzymatycznych, immunoelektroforetycznych z blotingiem i immunoprecypitacją. Reaktywność surowic antykoniugatowych badano w teście immunofluorescencyjnym z wykorzystaniem sortera komórek (FACS) zarówno na zabitych (termicznie, chemicznie), jak i żywych komórkach B. pertussis. Dane uzyskane w cytofluorymetrii przepływowej wskazują, że surowice te znakowały z wysoką intensywnością fluorescencji ponad 95% populacji żywych komórek bak­teryjnych.

          Zbadanie właściwości antyendotoksynowych i bakteriobójczych uzyskanych przeciwciał wobec różnych szczepów B. pertusis zaplanowano w ramach badań statutowych na rok 2000. W przypadku otrzymania pozytywnych wyników preparat mógłby w przyszłości być zastosowany jako dodatkowy składnik bezkomórkowej szczepionki przeciwkrztuścowej polepszający jej właściwości ochronne.

Wykonawcy: dr W. Jachymek, dr T. Niedziela, mgr J. Czaja

Temat nr 24

Wpływ polipeptydu bogatego w prolinę (PRP) z siary owiec i jego aktywnego nonapeptydowego (NP) fragmentu na produkcję NO i O₂^– w makrofagach

Laboratorium Immunochemii Ogólnej, kierownik: doc. dr Maria Janusz

          Polipeptyd bogaty w prolinę (PRP) wykazujący właściwości immunoregu­latorowe został wykryty w 1974 r. przez Janusz i wsp. w naszym Instytucie. PRP indukuje dojrzewanie i różnicowanie się tymocytów i wpływa na humoralną i komórkową odpowiedź immunologiczną, zarówno in vivo jak i in vitro. Preparat nie jest gatunkowo swoisty i wykazał aktywność u myszy, szczurów, ludzi. Jak wykazały ostatnie badania, PRP jest mieszaniną peptydów o ciężarze cząsteczkowym 6 000–   10 000 (SDS-PAGE), bogatych w prolinę (25%) i hydrofobowe aminokwasy (50%). Trawienie proteolityczne PRP pozwoliło na wyizolowanie nonapeptydowego frag­mentu (NP): Val-Glu-Ser-Tyr-Val-Pro-Leu-Phe-Pro wykazującego immunoregula­torowe właściwości podobne do PRP. Podobne właściwości wykazuje heksapeptyd (HP): Tyr-Val-Pro-Leu-Phe-Pro, będący C-końcowym fragmentem nonapeptydu.

          PRP posiada również właściwości psychotropowe, polepszające procesy pa­mięciowe u ludzi. Właściwości te zostały wykorzystane, z dobrym skutkiem, w próbach leczenia ludzi z chorobą Alzheimera. Preparat w formie tabletek pod nazwą Colostrinin^O został wprowadzony do prób klinicznych. Hipotezy dotyczące mechaniz­mów powstawania procesów neurodegeneracyjnych w chorobie Alzheimera uwzględ­niają, między innymi, możliwość stymulacji tych procesów przez nadmierną sekrecję NO i O₂^– przez komórki mikrogleju, komórki nerwowe i limfocyty.

          Celem wykonanych badań było określenie wpływu PRP, NP, HP, oligomerów HP oraz enancjomeru D na indukcję NO i O₂^– w makrofagach myszy i określenie możliwości zastąpienia siarowego kompleksu PRP przez badane peptydy w indukcji różnych funkcji w komórkach. Peptydy zostały zsyntetyzowane w Zakładzie Chemii Uniwersytetu Gdańskiego przez prof. dra Gotfryda Kupryszewskiego.

          Badane peptydy wykazywały zróżnicowane efekty. Najwyższą aktywność bio­logiczną wykazywały w dawkach 100 mg preparatu/ml. Najwyższą zdolność do induk­cji NO i O₂^– wykazywał PRP. Względnie niską aktywność wykazywał HP. Wyraźny wzrost zdolności do indukcji NO i O₂^– obserwowano w przypadku tetrameru HP. Enancjomer D heksapeptydu był nieaktywny. Jakkolwiek badane peptydy, zwłaszcza w wysokich stężeniach (100 mg/ml), indukowały powstawanie O₂^–, to obserwowany wzrost nie był statystycznie znamienny.

          Uzyskane wyniki wskazują, że maksymalne efekty indukowania NO lub O₂^– obserwuje się przy stężeniu 100 mg preparatu/ml/6 x 10⁵ komórek. Taka sama ilość PRP (100 mg) znajduje się w tabletce Colostrininy^O podawanej doustnie pacjentom z chorobą Alzheimera.

          Przedstawione wyniki mogą przyczynić się do zrozumienia mechanizmu terapeutycznego działania PRP (Colostrininy^O) w chorobie Alzheimera, a z drugiej strony mogą ułatwić znalezienie peptydu (-ów), otrzymanych na drodze syntezy chemicznej, które mogłyby zastąpić kompleks PRP izolowany z siary.

Wykonawcy: prof. dr J. Lisowski, mgr A. Zabłocka, dr J. Mikulska

Temat nr 25

Wpływ peptydów – analogów aktywnego fragmentu PRP na komórki układu odpornościowego myszy i świnek morskich

Laboratorium Immunochemii Ogólnej, kierownik: doc. dr Maria Janusz

          Opisany w poprzednim raporcie (temat nr 24) polipeptyd bogaty w prolinę (PRP) wykazuje właściwości immunoregulatorowe indukując dojrzewanie i różnico­wanie się tymocytów. PRP wpływa in vivo i in vitro na humoralną i komórkową odpowiedź immunologiczną i nie wykazuje swoistości gatunkowej. Z produktów trawienia proteolitycznego został wyizolowany nonapeptydowy fragment (NP): Val-Glu-Ser-Tyr-Val-Pro-Leu-Phe-Pro wykazujący u myszy immunoregulatorowe właściwości podobne do całej cząsteczki. W badaniach na myszach właściwości biologiczne podobne do PRP i NP posiada również heksapeptyd (HP) będący C-końcowym fragmentem nonapeptydu. Jednak  niektóre aktywności NP i HP, takie jak np. indukcja cytokin w komórkach mysich lub ludzkich, są znacznie niższe w porównaniu z PRP.

          Celem przedstawionych prac było poszukiwanie syntetycznych peptydów, analogów NP i HP, które wykazywałyby aktywności immunotropowe możliwie przewyższające aktywności HP, NP lub PRP. Peptydy będące oligomerami NP i HP (NP2, HP2, HP3 i HP4) oraz ich enancjomery D (NPD i HPD) zostały zsyntetyzowane w Zakładzie Chemii Uniwersytetu Gdańskiego (prof. dr Gotfryd Kupryszewski). Immunotropową aktywność oznaczano we współpracy z Laboratorium Immuno­farmakologii naszego Instytutu, mierząc ochronne działanie peptydów przed apoptozą indukowaną w mysich tymocytach przez hydrokortyzon.

          Najsilniejsze działanie ochronne wykazywał pełny kompleks PRP. Nonapeptyd wykazywał niższą aktywność w porównaniu z całą cząsteczką, heksapeptyd niższą niż NP. W przeciwieństwie do nonapeptydu, oligomeryzacja heksapeptydu znacznie podwyższała efekt ochronny, również wyższą aktywność obserwowano w przypadku enancjomerów D.

          W warunkach przeprowadzonych doświadczeń, w przeciwieństwie do ConA, PRP nie wykazywał wpływu na ekspresję receptora dla IL-2 (CD25) na limfocytach mysich. Nie przeprowadzano więc dalszych doświadczeń z NP i jego pochodnymi.

          Uzyskane wyniki wskazują na potencjalną możliwość zastąpienia naturalnego kompleksu izolowanego z siary – PRP – przez syntetyczne peptydy, w celu wywołania określonych zmian w funkcji limfocytów.

Wykonawcy: prof. dr J. Lisowski, mgr A. Zabłocka, dr J. Mikulska

Temat nr 26

Wykorzystanie białka fuzyjnego selektynaE-FcIgG w badaniach nad ligandami dla selektyny E

Laboratorium Glikobiologii, kierownik: doc. dr Maciej Ugorski

          Niniejszy temat stanowi kolejny etap badań naszego zespołu nad charakterys­tyką i identyfikacją ligandów dla selektyn obecnych na komórkach nowotworowych, mogących odgrywać ważną rolę w tworzeniu przerzutów. Celem aktualnie prowa­dzonych badań jest identyfikacja ligandów dla selektyny E obecnych na komórkach CX-1 ludzkiego raka okrężnicy przy użyciu białka fuzyjnego utworzonego przez zewnątrzkomórkową domenę ludzkiej selektyny E i fragment Fc mysich IgG1.

          W pierwszym etapie skonstruowano wektor ekspresyjny pSG5sELAM1/MFcIgG zawierający cDNA dla domeny lektynowej, domeny EGF i domeny SCR selektyny E oraz regionu zawiasowego i domen C_H2 i C_H3 mysich IgG1. Do produkcji białka fuzyjnego wykorzystano komórki CHO-Pro5, które stabilnie transfekowano powyż­szym wektorem metodą fosforanowo-wapniową. Białko selektyna E-fragment Fc IgG z płynu hodowlanego izolowano metodą chromatografii powinowactwa na złożu sefaroza-białko A.

          Następnie podjęto badania zmierzające do określenia prawidłowości budowy tak otrzymanej chimery białkowej. Do tego celu wykorzystano monoklonalne przeciwciała skierowane przeciwko ludzkiej selektynie E oraz kozie przeciwciała poliklonalne skierowane przeciwko IgG myszy. Fakt, że oba przeciwciała wiążą się w immunoblotingu do białka fuzyjnego wytwarzanego przez komórki CHO-Pro5 wskazuje na zachowanie przez jego składowe, tzn. zewnątrzkomórkową domenę selektyny E i fragment Fc IgG, właściwych im cech budowy. Również masa cząstecz­kowa białka wykrywanego przez te przeciwciała jest zbliżona do oczekiwanej.

          Kolejny etap badań obejmował ocenę właściwości funkcjonalnych otrzymanego białka fuzyjnego. Jako komórek modelowych użyto komórek ludzkiej białaczki HL-60, które charakteryzują się wysoką ekspresją antygenu sjalo-Lewis^x. Co więcej, z literatury wiadomo, że komórki te zdolne są do wiązania podobnego typu białek chimerycznych (Dietsch i wsp., 1993). Z przeprowadzonych eksperymentów wynika, że otrzymane przez nas białko ma zdolności wiązania się do powierzchni komórek HL-60, co potwierdza wcześniejsze wyniki immunoblotingu wskazujące na popraw­ność jego budowy. Fakt, że do wykrycia antygenu sjalo-Lewis^x koniecznym było wykorzystanie systemu detekcyjnego charakteryzującego się wysoką czułością może wskazywać na niskie powinowactwo w oddziaływaniach selektyny E z jej cukrowymi ligandami. Inne możliwe tłumaczenie, to zbyt niskie stężenie białka fuzyjnego w użytym preparacie. Tym też najprawdopodobniej tłumaczyć można negatywne wyniki pierwszych eksperymentów nad wiązaniem „chimery” selektyna E-FcIgG do komórek CX-1.

          W przyszłych badaniach, aby zwiększyć wydajność procesu oczyszczania białka fuzyjnego planuje się użycie w miejscu białka A, nośnika z białkiem G.

Wykonawcy: dr A. Laskowska, mgr inż. D. Baczyńska

Temat nr 27

Oznaczenie struktury glikolipidów odpowiedzialnych za poliaglutynację typu ‘NOR’ erytrocytów ludzkich

Laboratorium Immunochemii Glikokoniugatów, kierownik: prof. dr Elwira Lisowska

          Pierwszy przypadek poliaglutynacji nazwanej NOR został opisany przez Harrisa i in. (Vox Sang. 42, 134, 1982). Autorzy wykazali jedynie, że poliaglutynacja ta nie wykazuje cech innych znanych dziedzicznych poliaglutynacji, nasila się po traktowaniu erytrocytów proteazami i jest hamowana przez ptasi antygen P1 (struktura P1: Gala1-4Galb1-4GlcNAc-). Drugi przypadek dziedzicznej poliaglutynacji wyka­zującej cechy poliaglutynacji typu NOR został ostatnio zidentyfikowany w polskiej rodzinie przez dr Kuśnierz-Alejską i prof. Seyfried (Instytut Hematologii i Trans­fuzjologii, Warszawa), które przesłały nam krwinki NOR do badań immuno­chemicznych. Nasze badania wykonane w 1998 r. wykazały, że erytrocyty NOR (grupy A2) zawierają unikalne neutralne glikolipidy, wykrywane metodą chromato­grafii cienkowarstwowej (TLC) za pomocą lektyny Griffonia simplicifolia IB4 (GSL-IB4) (Kuśnierz-Alejska i in., Transfusion, 39, 32, 1999). Izolektyna GSL-IB4 (swoista dla struktury Gal1-3Gal) barwiła silnie dwa prążki w glikolipidach wydzielonych z krwinek NOR, jeden migrujący w rejonie pentaglikozyloceramidów (nazwany tutaj NOR1) i drugi migrujący wolniej (wyżejcząsteczkowy, nazwany NOR2). Otrzymane wyniki nasunęły przypuszczenie, że są to glikolipidy z łańcuchami oligosacharydowymi zakończonymi sekwencją Gal1-3Gal-. Epitop ten jest obecny w dużych ilościach w glikoproteinach i glikolipidach ssaków i nie jest wykrywany u ludzi. Natomiast przeciwciała anty-Gal1-3Gal są obecne u wszystkich ludzi i są jedną z głównych przyczyn ostrego odrzucania ksenoprzeszczepów. Wykazano, że gen kodujący transferazę galaktozy (1,3Gal-T) zaangażowaną w syntezę tego epitopu jest obecny w ludzkim genomie w formie zmutowanej, na skutek czego nie jest wyrażony. Wydawało się możliwe, że u rzadko spotykanych osób z erytrocytami typu NOR jest obecna funkcjonalna forma 1,3Gal-T i zachodzi synteza epitopu Gal1-3Gal- oraz, że poliaglutyninami anty-NOR są powszechnie obecne przeciwciała anty-Gal1-3Gal-. Celem badań zaplanowanych na 1999 r. było udowodnienie tego przypuszczenia.

          Przystępując do badań przypuszczaliśmy, że glikolipid NOR1 może być iden­tyczny z głównym glikolipidem erytrocytów królika, Gala1-3Galb1-4GlcNAcb1--3Galb1-4Glc-Cer (aGal-nLc4), a glikolipid NOR2 zawiera dłuższy łańcuch oligo­sacharydowy z identyczną sekwencją końca nieredukującego. Dla dokonania porów­nań oczyściliśmy aGal-nLc4 z błon erytrocytów króliczych i stwierdziliśmy, że migruje on w TLC podobnie jak NOR1. Dalsze badania wykazały jednak, że aGal-nLc4 i NOR1 nie są identyczne. Pierwsze spostrzeżenie wynikło z porównania czułości barwienia obu glikolipidów na płytce TLC za pomocą orcynolu (barwienie chemiczne części cukrowej) i lektyny GSL-IB4. Otrzymane wyniki wykazały, że glikolipid NOR1 albo barwi się słabiej orcynolem, lub reaguje silniej z GSL-IB4 niż aGal-nLc4. W celu potwierdzenia, że antygen NOR zawiera końcową resztę aGal i dla uzyskania informacji o jego budowie, traktowano wyeluowane z płytki TLC glikolipidy NOR1 i NOR2 (oraz króliczy aGal-nLc4, jako kontrolę) a-galaktozydazą oczyszczoną z ziaren surowej kawy i analizowano produkty metodą TLC z użyciem aglutyniny I z Ricinus communis (RCA-I). RCA-I (rozpoznająca końcowe reszty galaktozy) reaguje silnie z paraglobozydem krwinek, z aGal-nLc4, i z NOR1. Jak można było przewidzieć, traktowanie aGal-nLc4 a-galaktozydazą powodowało znikanie prążka substratu i pojawienie się prążka paraglobozydu:

Gala1-3Galb1-4GlcNAcb1-3Galb1-4Glc-Cer ® Galb1-4GlcNAcb1-3Galb1-4Glc-Cer +Gal

                         aGal-nLc4                                            paraglobozyd (nLc4)

Glikolipidy NOR1 i NOR2 były również hydrolizowane przez a-galaktozydazę, ale do ich kompletnej hydrolizy wymagana była większa ilość enzymu i/lub dłuższy czas reakcji. Ponadto, lektyna RCA-I nie wykrywała paraglobozydu jako produktu hydrolizy glikolipidu NOR1, co sugerowało, że produkt reakcji nie jest zakończony resztą galaktozy. Kluczowy dowód na odmienność epitopów glikolipidów NOR i króliczego aGal-nLc4 został otrzymany przez badanie ich reakcji z przeciwciałami ludzkimi. Przeciwciała anty-Gala1-3Gal oczyszczono przez chromatografię powino­wactwa na glikoforynie erytrocytów świńskich, która zawiera liczne O-glikany zakończone tą sekwencją. Związane do immunoadsorbentu i wyeluowane galaktozą przeciwciała reagowały silnie z aGal-nLc4, ale nie wiązały się do glikolipidów NOR. Glikolipidy NOR były natomiast wykrywane surowicą pozbawioną przeciwciał anty-Gala1-3Gal (wymytą z immunoadsorbentu buforem), oraz przeciwciałami zaabsorbo­wanymi i wyeluowanymi z sieciowanych glutaraldehydem erytrocytów NOR.

          Otrzymane wyniki potwierdziły, że glikolipidy odpowiedzialne za poliagluty­nację typu NOR są zakończone resztą a-galaktozy, ale mimo, że reagują silnie z lektyną GSL-IB4 uważaną za swoistą dla sekwencji Gala1-3Gal, nie reagują ze znanymi ksenoprzeciwciałami ludzkimi anty-Gala1-3Gal. Wykazaliśmy obecność w ludzkich surowicach odrębnych przeciwciał anty-NOR, które z kolei nie wykazywały reakcji krzyżowych ze strukturą Gala1-3Gal. Te nieoczekiwane wyniki skompliko­wały problem i jednocześnie uczyniły go bardziej interesującym, gdyż sugerują powszechną obecność w ludzkich surowicach nowego typu ‘naturalnych’ przeciwciał antycukrowych. Wyjaśnienie budowy glikolipidów NOR i swoistości przeciwciał anty-NOR będzie przedmiotem naszych dalszych badań w ramach otrzymanego grantu KBN. Otrzymane wyniki były prezentowane w formie wykładu (E. Lisowska) na Symposium „Molecular Immunology of Complex Carbohydrates II” w Taipei (Taiwan).

Wykonawcy: doc. dr M. Duk, inż. D. Syper

Temat nr 28

Identyfikacja epitopu rozpoznawanego przez dwa przeciwciała monoklonalne anty-Fy^a

Laboratorium Immunochemii Glikokoniugatów, kierownik: prof. dr Elwira Lisowska

          Struktura antygenu Duffy ludzkich erytrocytów została poznana na podstawie oznaczenia sekwencji kodującej cDNA. Jest to glikoproteina zbudowa z 338 lub 336 (główna izoforma) aminokwasów. Antygen Duffy występuje w dwóch allelicznych formach Fy^a i Fy^b różniących się od siebie jedną resztą aminokwasową w pozycji 42, Gly w Fy^a i Asp w Fy^b.

          Antygen Duffy, który jest receptorem chemokin i niektórych pasożytów malarii występuje nie tylko w krwinkach ale również w komórkach śródbłonka naczyń wło­sowatych różnych organów oraz komórkach Purkinjego w móżdżku. Zaproponowano dla niego nazwę DARC (Duffy antigen receptor for chemokine). Jest to białko trans­membranowe przebijające siedmiokrotnie błonę komórkową. N-końcowy zewnątrz­komórkowy fragment (aa 1-64) zawiera epitopy Fy^a/Fy^b, epitop Fy6 wspólny dla form Fy^a i Fy^b oraz miejsca wiążące chemokiny i pasożyty malarii.

          Liczba przeciwciał monoklonalnych rozpoznających antygeny Duffy jest ograniczona. Znane są zaledwie trzy mysie przeciwciała monoklonalne anty-Fy6, które charakteryzowaliśmy wcześniej i dwa ludzkie monoklonalne przeciwciała anty-Fy^a, które były przedmiotem naszych badań w bieżącym roku sprawozdawczym.

          Identyfikacji epitopów rozpoznawanych przez przeciwciała monoklonalne anty-Fy^a, 655 i 5T72A (otrzymane od dra Blancharda, Nantes, Francja), dokonano za pomocą peptydów syntetyzowanych na plastikowych bolcach. Zsyntetyzowano szereg zachodzących na siebie oktapeptydów odpowiadających sekwencji łańcucha poli­peptydowego antygenu Duffy pomiędzy aminokwasami Asp³⁴ i Pro⁵⁰. Wiązanie przeciwciał do tych peptydów wykazało, że rozpoznają one nieidentyczne zachodzące na siebie epitopy. Przeciwciało 5T72A wiązało silnie peptydy zawierające wspólny motyw ⁴⁰DYGA⁴³, podczas gdy przeciwciało 655 wiązało się tylko do peptydów posiadających wspólną sekwencję ⁴¹YGANLE⁴⁶.

          Jedynym heptapeptydem wiążącym silnie obydwa przeciwciała był heptapeptyd ⁴⁰DYGANLE⁴⁶ wybrano go więc do analizy podstawieniowej. W tym celu zsyntety­zowano i testowano 140 peptydów w których każdy aminokwas heptapeptydu ⁴⁰DYGANLE⁴⁶ został podstawiony 19 innymi aminokwasami. Wykazano, że dla epitopu 5T72A istotne są reszty Asp⁴⁰, Gly⁴² i Ala⁴³, które nie mogły być zastąpione innymi aminokwasami. Pozostałe reszty aminokwasowe heptapeptydu mogły być zastąpione przez niektóre aminokwasy (Tyr⁴¹, Asn⁴⁴) lub przez większość amino­kwasów (C terminalna reszta Glu⁴⁶). Wyniki analizy zastąpieniowej otrzymane dla przeciwciała 655 były odmienne. Aminokwas N-terminalny Asp⁴⁰ mógł być zastąpiony przez wszystkie aminokwasy a Ala⁴³ mogła być zastąpiona przez kilka aminokwasów. Pozostałe reszty heptapeptydu macierzystego Tyr⁴¹, Gly⁴², Asn⁴⁴, Leu⁴⁵ i Glu⁴⁶ są istotne, gdyż nie mogły być zastąpione innymi aminokwasami. Wyniki te wykazują, że testowane monoklonalne przeciwciała rozpoznają różne epitopy w antygenie Fy^a. W obydwu epitopach istotna jest reszta Gly⁴², która odróżnia antygen Fy^a od Fy^b. Jeśli ważność poszczególnych aminokwasów w epitopach dla przeciwciał 5T72A i 655 wyrazimy przez wielkość liter, epitopy te będą się przedstawiać następująco:

5T72A         DYGANLE

655:             DYGANLE

          Główna różnica pomiędzy epitopami 5T72A i 655 polega na tym że, reszta Asp⁴⁰ jest niezbędna dla reakcji z przeciwciałem 5T72A, i nie ma żadnego znaczenia dla przeciwciała 655, natomiast reszta Glu⁴⁶ jest nie zastępowalna w epitopie dla przeciwciała 655, a dla reakcji z przeciwciałem 5T72A nie ma żadnego znaczenia.

Analiza epitpów antygenu Duffy, wskazuje na różnice w rozpoznawaniu tego samego fragmentu łańcucha polipeptydowego przez różne przeciwciała. Scharakteryzowane przeciwciała monoklonalne mogą służyć do wykrywania antygenu Duffy nie tylko w erytrocytach, ale i innych komórkach oraz być pomocne w definiowaniu miejsc wiążących chemokiny i pasożyty malarii w antygenie Duffy.

Wykonawcy: dr K. Waśniowska, mgr D. Syper

Temat nr 29

Badanie obecności antygenów grupowych A i B w ludzkiej glikoforynie A

Laboratorium Immunochemii Glikokoniugatów, kierownik: prof. dr Elwira Lisowska

          Antygeny grupowe układu ABO(H) są znanymi od kilkudziesięciu lat struk­turami cukrowymi reprezentującymi nieredukujące zakończenia oligosacharydów w glikoproteinach i glikolipidach erytrocytów i wielu innych tkanek. Glikoforyna A (GPA) jest główną sjaloglikoproteiną w błonie erytrocytów ludzkich (na jednej krwince występuje ok. 1 mln kopii tego białka) i zawiera dwa rodzaje oligosacha­rydów: jeden łańcuch N-glikozydowy i ok. 15 łańcuchów O-glikozydowych. Główne formy glikanów GPA nie zawierają struktur ABH, ale były doniesienia, że struktury te występują na niektórych O-glikanach GPA. Nowe możliwości metodyczne skłoniły nas do zbadania tego problemu. Uzyskane przez nas wcześniej wyniki określiły struktury O-glikanów GPA z determinantami A i B. W roku bieżącym badania nasze skoncentrowane były na N-glikanach.

          W przedstawionych tu badaniach analizowano glikoforynę wydzieloną z krwinek grupy A (GPA-A) oraz krwinek grupy B (GPA-B). Surowe preparaty roz­dzielano metodą filtracji żelowej w buforze zawierającym SDS; frakcje zawierające wyłącznie glikoforynę A były wydzielone na podstawie elektroforezy SDS-PAGE. Oczyszczone preparaty glikoforyny degradowano stosując b-eliminację w warunkach redukujących, a produkty tej degradacji rozdzielano metodą filtracji żelowej. Uzys­kiwano w ten sposób frakcje wolnych, zredukowanych O-glikanów oraz frakcje N-glikanów w postaci glikopeptydów. Te ostatnie zostały poddane drastycznej degradacji alkalicznej w celu pozbawienia części białkowej.

          W preparatach wydzielonych łańcuchów cukrowych wykonano oznaczenie sfingozyny. Nie wykrycie sfingozyny świadczyło o tym, że badane preparaty pochodzą od oligosacharydów glikoforyny i nie są zanieczyszczone glikosfingo­lipidami, które mogą być nośnikami antygenów ABH.

          We współpracy z prof. Bo Nilssonem (Defence Research Establishment, Umea, Szwecja), stosując spektrometrię masową ES-MS/MS przy zastosowaniu techniki nanoflow, wykonano analizę zredukowanych frakcji N-glikanów w formie pochod­nych permetylowanych. Dla próbki pochodzącej z GPA-A uzyskano m. in. jon m/z 1649, a dla próbki z GPA-B jon m/z 1629, oba w postaci adduktów amonowych podwójnie zjonizowanych [M + 2NH₄]²⁺. Jony te, analizowane w systemie CID--MS/MS, dostarczyły zestawu jonów sekwencyjnych potwierdzających obecność determinantów grupowych A i B. Masy tych jonów odpowiadają przedstawionym strukturom dwuantenowym, w których jedna z anten jest zakończona antygenem grupowym A lub B w zależności od pochodzenia łańcucha oligosacharydowego, z GPA-A bądź z GPA-B:

Struktury te są obecne w małym procencie N-glikanów GPA

Wykonawcy: mgr inż. M. Podbielska, doc. dr H. Krotkiewski

Temat nr 30

Charakterystyka i określenie epitopów rozpoznawanych przez przeciwciało NaM70-3C10, które reaguje z białkiem pasma 4.1 i z glikoforyną A z ludzkich erytrocytów

Laboratorium Immunochemii Glikokoniugatów, kierownik: prof. dr Elwira Lisowska

          Przeciwciało monoklonalne NaM70-3C10 klasy IgM zostało otrzymane w labo­ratorium dra Dominique Blancharda (Nantes, Francja) w wyniku szczepienia myszy ludzkimi erytrocytami. Przeciwciało aglutynuje erytrocyty natywne lub traktowane trypsyną, chymotrypsyną albo neuraminidazą, lecz nie aglutynuje erytrocytów trakto­wanych papainą. Aglutynację hamuje oczyszczona glikoforyna A. Za pomocą immu­noblotingu wykazano, że przeciwciało to wiąże się do glikoforyny A oraz białka pasma 4.1. Można więc było przypuszczać, że glikoforyna A i białko pasma 4.1 zawierają regiony o zbliżonej sekwencji, które są rozpoznawane przez przeciwciało 3C10.

          Aby odpowiedzieć na pytanie, który fragment glikoforyny A jest rozpoznawany przez to przeciwciało, zsyntetyzowano oktapeptydy obejmujące reszty aminokwasowe 20-66 glikoforyny A. Wykazano, że przeciwciało rozpoznaje sekwencje: 49RTVYPPEE56, 50TVYPPEEE57,51VYPPEEET58, 52YPPEEETG59 i 53PPEEETGE60. Wspólnym ele­mentem tych peptydów jest sekwencja PPEEE. Białko pasma 4.1 zawiera zbliżoną sekwencję: 395PPEQA399. Zsyntetyzowano oktapeptydy obejmujące reszty amino­kwasowe 389-404 białka pasma 4.1 i wykazano, że przeciwciało 3C10 wiąże się najlepiej do peptydu 394EDEPPEQA401. Peptydy rozpoznawane przez to przeciwciało mają więc wspólną, charakterystyczną sekwencję: PPE.

          W celu dokładnego określenia, jaka jest minimalna sekwencja rozpoznawana przez przeciwciało 3C10, zsyntetyzowano peptydy o sekwencjach: PE, PPE, PPEE, PPEEE, PEE, PPEQ, EPPEQ, EPPEQA i DEPPEQA. Stwierdzono, że przeciwciało wiąże się najsilniej do peptydu PPEEE (100% maksymalnego wiązania) i PPEE (70%). Podstawienie kwasu glutaminowego przez glutaminę na czwartej pozycji takiego tetrapeptydu (w wyniku czego powstaje peptyd o sekwencji PPEQ) powoduje niewielkie obniżenie wiązania (z 70% do 50% maksymalnego wiązania). Jeżeli jednak peptyd PPEQ znajduje się w otoczeniu takich reszt aminokwasowych, jakie znajdują się w białku pasma 4.1 (peptyd DEPPEQA), to powinowactwo przeciwciała zwiększa się do 75% maksymalnego wiązania. Peptydy: PE, PPE i PEE wykazują niewielkie powinowactwo wobec przeciwciała (do 25%).

          Podsumowując, wykazano, że przeciwciało monoklonalne 3C10 rozpoznaje epitopy w glikoforynie A i białku pasma 4.1. Epitopy te mają podobną sekwencję aminokwasową, a ich wspólnym elementem jest sekwencja PPE. Reszty amino­kwasowe, które znajdują się w bezpośrednim sąsiedztwie tego epitopu: TVYPPEEE w glikoforynie A i DEPPEQA w białku pasma 4.1 podwyższają powinowactwo przeciwciała wobec tych epitopów.

Wykonawca: dr M. Czerwiński

Temat nr 31

Rozpuszczalna forma antygenu karcynoembrionalnego (CEA). Klonowanie i ekspresja rekombinacyjnej formy CEA obejmującej domenę N-końcową
i trzy domeny wewnętrzne z histydylowym peptydem powinowactwa
na C-końcu (CEA-637His)

Laboratorium Immunochemii Glikokoniugatów, kierownik: prof. dr Elwira Lisowska

          W procesie transformacji nowotworowej, głównie w rakach przewodu pokar­mowego, płuc i piersi, obserwuje się znaczny wzrost stężenia wolnej, rozpuszczalnej formy antygenu karcynoembrionalnego (CEA) w surowicy pacjentów. Zmiana pozio­mu CEA jest wyraźnym wskaźnikiem zaawansowania choroby nowotworowej, jak również ważnym parametrem w długoterminowym monitorowaniu pacjentów po zabiegach chirurgicznych (ponowny wzrost poziomu CEA w surowicy pacjenta świadczy o nawrocie nowotworu lub pojawianiu się przerzutów nowotworowych).

          Sklonowanie genu kodującego CEA umożliwiło wyznaczenie sekwencji amino­kwasowej oraz ustalenie struktury II- i III-rzędowej.

          Celem niniejszego projektu badawczego było otrzymanie klonów komórkowych wytwarzających rozpuszczalny antygen CEA różniący się jedynie podstawieniem reszty seryny przez resztę treoniny w pozycji 272 oraz brakiem pięciu, C-końcowych, reszt aminokwasowych (638-642) warunkujących przyłączenie GPI i zakotwiczenie CEA w błonie komórkowej. Otrzymane formy rozpuszczalne pozwoliłyby na uniknię­cie konieczności preparacji CEA z trudno osiągalnych przerzutów raka przewodu pokarmowego do wątroby oraz stosowanie rekombinacyjnego CEA do badań nad rolą wolnej formy antygenu CEA.

          Realizując badania przygotowano eukariotyczny wektor ekspresyjny pSG5--CEA637His kodujący całkowitą cząsteczkę CEA mającą na C-końcu histydylowy peptyd powinowactwa, His tag, a następnie użyto otrzymany wektor do transfekcji komórek jajnika chomika chińskiego (CHO). Wyselekcjonowane, stabilne trans­fektanty wydzielały do pożywki hodowlanej wolną formę CEA.

          cDNA dla CEA uzyskano w wyniku trawienia wektora KN (Biomedical Research Institute, Osaka, Japan) enzymami restrykcyjnymi EcoRI a następnie AlwN1. Eukariotyczny wektor ekspresyjny pSG5CEA637His przygotowano przez wklono­wanie cDNA kodującego II- i III- domenę CEA w wektor pSG5CEA272His (zadanie badawcze na rok 1998), zawierający cDNA dla N-końcowej i I-domeny CEA.

          Otrzymany wektor pSG5CEA637His, zdolny do indukcji syntezy sekrecyjnej formy CEA użyto, w obecności wektora selekcyjnego pSV2Neo, do kotransfekcji komórek CHOPro5. Otrzymane klony o stabilnej transfekcji wykazywały zróżnico­wany poziom ekspresji rozpuszczalnej formy CEA637His. Obecność rozpuszczalnej formy CEA637His, wydzielanej do pożywki hodowlanej, sprawdzano metodą dot-blot, z wykorzystaniem przeciwciał poliklonalnych anty-CEA. Klony o wysokiej ekspresji CEA637His subklonowano techniką „granicznego rozcieńczenia”. Uzyskano dwa subklony CHOPro5/CEA637His 4/9 i 4/15, które zostaną wykorzystane do produkcji rekombinacyjnej, rozpuszczalnej formy CEA637His.

Wykonawcy: dr A. Krop-Wątorek, dr M. Czerwiński

Temat nr 32

Charakterystyka epitopów rozpoznawanych przez monoklonalne przeciwciała o swoistości antyglikoforyna C, przy użyciu rekombinantowych form glikoforyny C

Laboratorium Immunochemii Glikokoniugatów, kierownik: prof. dr Elwira Lisowska

          Glikoforyna C (GPC) występuje w niewielkiej ilości w erytrocytach ludzkich, lecz odgrywa istotną rolę w utrzymywaniu kształtu erytrocytu, poprzez interakcję stosunkowo długiego fragmentu cytoplazmatycznego z białkami szkieletu komórko­wego. Znane są rzadko występujące, naturalne warianty genetyczne GPC, typu Yus i Gerbich, powstałe odpowiednio w wyniku delecji sekwencji nukleotydowych obejmu­jących reszty aminokwasowe 17–35 oraz 36–63. Z uwagi na trudną dostępność tych mutantów do badań, otrzymano rekombinantowe formy GPC, w tym oba jej warianty typu Yus i Gerbich, wykazujące ekspresję na powierzchni komórek CHO, i wykorzys­tano je do szczegółowej charakterystyki epitopów dla monoklonalnych przeciwciał (mAbs) o swoistości anty-glikoforyna C.

          Epitopy dla pięciu mAbs, otrzymanych w laboratorium dra Blancharda (Nantes, Francja), wstępnie charakteryzowano stosując standardowe metody, w tym wiązanie do natywnej i chemicznie modyfikowanej glikoforyny C (GPC) w teście ELISA oraz wiązanie do GPC natywnej i jej wariantu genetycznego typu Gerbich w immuno­blotingu. Ustalono, że przeciwciało NAM70-1G4 rozpoznaje N-końcową sekwencję aminokwasową łańcucha polipeptydowego GPC, z wolną grupą aminową i łańcuchem bocznym metioniny w pozycji 1. W epitopie biorą udział łańcuchy cukrowe związane z resztami seryny i treoniny w poz. 2 i 3. Epitopy dla przeciwciał NAM89-2G11, NAM19-3C4 i NAM98-3C1 były zlokalizowane wewnątrz N-końcowego fragmentu, natomiast dla przeciwciała NAM57-1F6, w obrębie C-końcowego cytoplazmatycz­nego fragmentu łańcucha polipeptydowego GPC. Rozpoznawane sekwencje, rozmiar epitopu i kluczowe reszty aminokwasowe zostały ustalone w oparciu o wiązanie przeciwciał do szeregu syntetycznych oktapeptydów, o sekwencjach odpowiadających wybranym fragmentom GPC. Stwierdzono, że przeciwciało NAM89-2G11 rozpoznaje sekwencję 16(LEGPDP)20, w której zasadniczą rolę odgrywa reszta leucyny w poz. 16. Przeciwciało NAM98-3C1 reagowało z epitopem o sekwencji 17/36(EPDPG)21/40, występującej dwukrotnie w łańcuchu polipeptydowym GPC. Bardzo słaba reakcja przeciwciała NAM19-3C4 z peptydowym epitopem o sekwencji 44(WPDGRME)50, sugerowała udział łańcucha cukrowego, w epitopie dla tego przeciwciała. Ostatnie z przeciwciał, NAM57-1F6 rozpoznawało sekwencję 110(QDPAL)115, w której klu­czową rolę odgrywała reszta glutaminy w poz. 110.

          Do dalszej szczegółowej charakterystyki epitopów dla trzech przeciwciał: NAM89-2G11, NAM19-3C4 i NAM98-3C1 wykorzystano rekombinantowe formy GPC, ekspresjonowane w komórkach CHO. Na podstawie wiązania tych przeciwciał do GPC natywnej i jej dwóch wariantów delecyjnych typu Yus i Gerbich, w metodzie cytofluorymetrii przepływowej, potwierdzono wiązanie przeciwciał do ustalonych wcześniej epitopów. Jednocześnie wykazano znaczenie łańcuchów cukrowych w epitopach dla przeciwciał NAM19-3C4 i NAM98-3C1. Przeciwciało NAM19-3C4 wymagało do wiązania obecności łańcucha cukrowego związanego z resztą seryny w pozycji 42. Natomiast łańcuch cukrowy związany z seryną w pozycji 15 najprawdo­podobniej sterycznie uniemożliwiał wiązanie przeciwciała NAM98-3C1 do sąsiadu­jącego peptydowego epitopu, obejmującego reszty aminokwasowe 17–21; przeciw­ciało to wiązało się jedynie do identycznej sekwencji w obrębie reszt 36–40.

          Zastosowanie rekombinantowych form GPC do charakterystyki epitopów dla wybranych przeciwciał, pozwoliło na ich precyzyjne zdefiniowanie. Stworzyło również, nowe możliwości dla badań nad mechanizmami reakcji przeciwciał z anty­genami glikopeptydowymi.

Wykonawca: dr E. Jaśkiewicz

Zakład Mikrobiologii

Temat nr 33

Cykliczne nukleotydy w komórkach układu immunologicznego –
badania czynników wpływających na poziom cAMP i cGMP w makrofagach i neutrofilach świnki morskiej

Laboratorium Białek Sygnałowych, kierownik: doc. dr Wojciech Gorczyca

          Celem badań w roku sprawozdawczym było:

1)    opracowanie czułego testu immunoenzymatycznego (tańszego od dostępnych), który pozwalałby mierzyć aktywności cyklazy adenylanowej i cyklazy guanylanowej w komórkach poprzez oznaczanie poziomu cyklicznych nukleotydów (cAMP i cGMP) syntetyzowanych przez te enzymy.

2)    wykorzystanie opracowanego testu do zbadania zdolności wybranych peptydów o stwierdzonym działaniu immunomodulatorowym do indukowania cyklicznych nukleotydów w makrofagach i neutrofilach.

3)    zbadanie korelacji pomiędzy zdolnością analizowanych peptydów do generowania określonych nukleotydów a adhezyjnymi właściwościami komórek.

W okresie objętym sprawozdaniem opracowano metodę uzyskiwania mono­specyficznych frakcji immunoglobulin (reagujących wyłącznie z cAMP lub z cGMP) z surowic otrzymanych przeciwko koniugatom cyklicznych nukleotydów z białkowym nośnikiem. W oparciu o uzyskane przeciwciała opracowano płytkowy test immuno­enzymatyczny (ELISA), który umożliwia oznaczanie femtomolowych ilości nukleo­tydów. Opracowany test wykorzystano do zbadania zdolności indukowania cyklicz­nych nukleotydów w makrofagach świnki morskiej oraz makrofagach i neutrofilach szczura przez następujące związki: forskolinę, nitroprusydek sodowy (SNP), przed­sionkowy peptyd natriuretyczny (ANP), peptyd chemotaktyczny N-formyl-Met-Leu--Phe (fMLF), kompleks peptydowy bogaty w prolinę pochodzący z siary (PRP) i peptydy PRP-pochodne. Stwierdzono, że forskolina powodowała podniesienie poziomu cAMP we wszystkich badanych komórkach, a efekt ten był silniejszy w obecności inhibitora (IBMX) fosfodiesteraz cyklicznych nukleotydów (PDE). Poziom cAMP ulegał również podwyższeniu w wyniku traktowania komórek fMLF, PRP oraz PRP-pochodnymi peptydami. W tym ostatnim przypadku efekt był nieznaczny. Aktywność cyklazy guanylanowej była stymulowana przez SNP w makrofagach otrzewnowych świnki morskiej, natomiast przez ANP w otrzewnowych makrofagach i neutrofilach szczura. Również tutaj obserwowaliśmy pozytywny wpływ inhibitora PDE. Rezultaty te świadczą o obecności w badanych komórkach zarówno cyklaz adenylanowych i guanylanowych jak i aktywnych fosfodiesteraz cAMP i cGMP. Jednocześnie uzyskane wyniki wskazują, że poziom ekspresji poszczególnych izoform enzymów zależy od rodzaju komórek. Obecnie badamy zdolność adhezyjną komórek, w których stwierdzono zmiany poziomu nukleotydów wywołane badanymi czynnikami.

Wyniki, które otrzymaliśmy dotychczas mają charakter zarówno poznawczy jak i praktyczny. Przygotowywane są do druku w formie publikacji, a część z nich została zaprezentowana podczas XXXV Zjazdu Polskiego Towarzystwa Biochemicznego w Olsztynie.

Wykonawcy: prof. dr A. Szewczuk, dr I. Kochanowska (do marca 1999),
mgr K. Krupińska-Karwacka, dr E. Kurowska i mgr M. Kobiałka

Temat nr 34

Białka wiążące wapń - badanie właściwości przeciwciał skierowanych przeciwko białkom z rodziny NCS

Laboratorium Białek Sygnałowych, kierownik: doc. dr Wojciech Gorczyca

          Zidentyfikowane ostatnio w siatkówce kręgowców białka GCAP1, GCAP2 oraz rekoweryna należą do rodziny tzw. neuronowych sensorów wapnia (NCS, neuronal calcium sensors). Uważa się, że związanie jonów wapniowych prowadzi do zmian konformacyjnych białek NCS oraz zmiany ich hydrofobowości w wyniku ekspono­wania modyfikującego aminokwas N-końcowy kwasu tłuszczowego (tzw. przełącznik wapniowo-mirystynowy). Rezultatem są zmiany aktywności enzymów efektorowych. Białka GCAP (Guanylyl Cyclase Activating Proteins) aktywują błonową cyklazę guanylanową w komórkach fotoreceptorowych. Rekowerynie przypisuje się rolę wapniozależnego regulatora kinazy rodopsynowej. Wykazano, że GCAP1 i reko­weryna mają związek z neurodegeneracyjnymi schorzeniami siatkówki.

          Badania wykonane w 1999 roku stanowią kontynuację tematu. Ich celem było stwierdzenie, czy białka GCAP1, GCAP2 i rekoweryna zmieniają swoje konformacje w wyniku wiązania jonów wapnia oraz w jaki sposób ewentualne zmiany konformacji wpływają na właściwości badanych białek, w tym np. na oddziaływanie ze swoistymi przeciwciałami. Zmiany konformacji zachodzące pod wpływem jonów wapnia badaliśmy zapisując widma fluorescencyjne każdego z wymienionych białek przy różnych stężeniach Ca2+ w próbie. Zmiany hydrofobowości białek badaliśmy w tych samych warunkach analizując ich oddziaływanie z fluorescencyjnym indykatorem jakim jest ANS. Stwierdziliśmy, że:

¨  w wyniku wiązania jonów wapnia CGAP1, CGAP2 i rekoweryna zmieniają swoje konformacje.

¨  GCAP1 i GCAP2 są białkami bardziej hydrofobowymi niż rekoweryna.

¨  wiązanie Ca²⁺ do rekoweryny powoduje znaczny wzrost hydrofobowości cząstecz­ki. W przypadku GCAP1 i GCAP2  zmiany hydrofobowości są mniejsze, a ich kierunek jest przeciwny w porównaniu z rekoweryną.

          Ponadto w okresie objętym sprawozdaniem uzyskaliśmy kolejne przeciwciała przeciwko GCAP1 oraz GCAP3 (nowe, niedawno zidentyfikowane białko rodziny NCS). Sprawdziliśmy warunki w jakich reaktywność już posiadanych i nowo uzyskanych przeciwciał jest optymalna. Zaobserwowaliśmy, że większość z badanych przeciwciał przeciwko białkom NCS silniej reaguje z nimi w obecności jonów wapnia.

          Wyniki, które otrzymaliśmy przygotowywane są do druku w formie publikacji i były prezentowane na IV Międzynarodowym Kongresie Polskiego Towarzystwa Badań Układu Nerwowego w Gdańsku i XXXV Zjeździe Polskiego Towarzystwa Biochemicznego w Olsztynie.

Wykonawcy: prof. dr A. Szewczuk, dr E. Kurowska, mgr M. Kobiałka,
dr I. Kochanowska (do marca 1999), mgr K. Krupińska-Karwacka

Temat nr 35

Badanie sekwencji nukleotydowej domen syntazy poliketydowej typu I

Laboratorium Biologii Molekularnej Mikroorganizmów,
kierownik: doc. dr Jolanta Zakrzewska-Czerwińska

          Przeprowadzone badania dotyczą organizacji i sekwencji nukleotydowej zespołu genów syntazy poliketydowej typu I ze Streptomyces coelicolor A3(2).

          Streptomyces coelicolor A3(2) jest modelowym szczepem promieniowca w badaniach genetycznych. Szczep ten wytwarza dwa związki o strukturze polikety­dowej, z których jeden jest antybiotykiem. W naszych badaniach stwierdziliśmy występowanie w genomowym DNA Streptomyces coelicolor A3(2) genów nowej, nie opisanej dotychczas syntazy poliketydowej. Sekwencja nukleotydowa i organizacja badanych genów jest charakterystyczna dla typu I syntaz o strukturze modularnej. Do syntaz typu I należą wszystkie znane syntazy wytwarzające antybiotyki makrolidowe. Wielofunkcyjne polipeptydy syntazy, o dużej masie cząsteczkowej, kodowane są przez pojedyncze geny. Każda domena enzymatyczna syntazy kodowana jest przez fragmenty genu, których ułożenie odpowiada kolejności w jakiej poszczególne domeny są aktywne podczas biosyntezy. Domeny enzymatyczne aktywne w pojedyn­czym cyklu kondensacji i redukcji łańcucha węglowego poliketydu wchodzą w skład modułu. Moduł jest to funkcjonalnie oraz strukturalnie wyodrębniony region polipeptydu syntazy a także fragment genu kodujący zespół domen. Badania zmie­rzające do poznania struktury i organizacji genów syntaz poliketydowych dostarczają informacji dotyczących sposobu funkcjonowania syntaz oraz regulacji ekspresji ich genów. Celem prowadzonych badań jest wyodrębnienie i zbadanie DNA kodującego domeny i moduły syntazy. Posłuży on do otrzymania rekombinantów genetycznych, które mogą wytwarzać nowe związki poliketydowe. Materiał do rekombinacji będzie stanowił DNA znanej syntazy poliketydowej, np. syntazy antybiotyku tylozyny.

          Przeprowadzone badania zostały podzielone na trzy zadania:

1.     Zbadanie sekwencji domeny tioesterazowej

          Oznaczono sekwencję nukleotydową klonowanych fragmentów BamHI (1788 pz, GenBank AF109727) i porównano ją z sekwencjami bazy danych. Porównanie ujawniło podobieństwo do genu tioesterazy występującego u różnych bakterii, a także do genu tioesterazy z kompleksu syntazy kwasów tłuszczowych szczura. Stwierdzono występowanie otwartej ramki odczytu o długości 861 pz. Koduje ona polipeptyd składający się z 286 aminokwasów, o szacunkowej masie cząsteczkowej ok. 30 500. Sekwencja aminokwasowa przypuszczalnego białka zawiera motyw charakterystyczny dla centrum aktywnego tioesteraz i jest podobna do sekwencji tioesterazy typu II (TEII). Zbadana sekwencja zawiera gen kodujący pojedynczy enzym – tioesterazę typu II. Podobieństwo przypuszczalnej tioesterazy do innych tioesteraz II wyraża się w:

1) podobieństwie sekwencji aminokwasowej;

2) masie cząsteczkowej białka;

3) odległości od N-końca białka seryny w centrum aktywnym (wynoszącej zwykle ok. 100 reszt aminokwasowych);

4) zachowawczej lokalizacji histydyny biorącej udział w katalizie;

5) występowaniu kodonu serynowego AGC

          W dalszym etapie badań planujemy zbadanie wpływu ekspresji in vivo bada­nego genu TEII na biosyntezę antybiotyku tylozyny. Prowadzimy również badania nad otrzymaniem poliklonalnych przeciwciał skierowanych przeciwko białku TEII.

2. Zbadanie sekwencji domeny syntazy 3-oksykwasów

          Domena syntazy 3-oksykwasów, zwana także domeną ketosyntazową (KS) jest podstawową domeną przeprowadzającą kondensację reszt acylowych podczas bio­syntezy poliketydów.

          Na podstawie doświadczeń hybrydyzacji DNA klonów kosmidowych z sondą o sekwencji domeny syntazy 3-oksykwasów (KS) stwierdzono występowanie w obrębie T7-końcowego fragmentu EcoRI klonu 1G7 regionu o homologicznej sekwencji. Fragment EcoRI o długości 1.7 kpz subklonowano, oznaczono jego sekwencję i przeprowadzono analizę porównawczą. Stwierdzono, że zbadana sekwencja stanowi fragment genu kodującego domenę syntazy 3-oksykwasów (KS), region łączący domenę KS z domeną AT (acylotransferazową) oraz N-końcowy fragment domeny AT. Domena KS zlokalizowana jest na początku (N-końcu) przypuszczalnego poli­peptydu syntazy. Domeny te wchodzą w skład tego samego modułu zlokalizowanego na jednym polipeptydzie. Ułożenie domen oraz ich sekwencja nukleotydowa i amino­kwasowa przypominają ułożenie i sekwencję domen innych syntaz poliketydowych typu I.

3. Uzyskanie mapy restrykcyjnej klonu 7G5 pochodzącego z biblioteki genomowego DNA Streptomyces coelicolor A3(2)

          W celu określenia lokalizacji domen syntazy oraz przygotowania wybranych fragmentów DNA do subklonowania wykonano mapę restrykcyjną klonu kosmido­wego 7G5 dla enzymu BamHI. Sporządzona mapa restrykcyjna pozwoliła na wytypo­wanie, a następnie klonowanie fragmentów, które sąsiadują z regionem oznaczonym jako „moduł X”. Obecnie badana jest sekwencja DNA pochodzącego z tego regionu.

          Przedstawione wyniki są przedmiotem przygotowywanej publikacji: „Putative type I polyketide synthase genes located in an unmapped region of the Streptomyces coelicolor A3(2) chromosome.”

Wykonawcy: dr K. Kuczek, mgr inż. M. Kotowska, mgr K. Pawlik

Temat nr 36

Wyjaśnienie funkcji białka DnaA jako czynnika transkrypcyjnego

Laboratorium Biologii Molekularnej Mikroorganizmów,
kierownik: doc. dr Jolanta Zakrzewska-Czerwińska

          Ostatnie badania wykazały, że białko DnaA pełni nie tylko funkcję inicjatora replikacji chromosomu bakteryjnego, ale również odgrywać może rolę czynnika transkrypcyjnego i to zarówno aktywatora jak i represora transkrypcji. Dotychczas nie wiadomo kiedy białko DnaA jest aktywatorem, a kiedy represorem. Interesujące wy­daje się poznanie sposobu, w jaki następuje regulacja transkrypcji genu dnaA u Streptomyces lividans. Nasuwa się też pytanie, jakie znaczenie ma występowanie dwóch boksów DnaA (jeden „silny”, drugi „słaby”) o orientacji „głowa-głowa” w regionie promotorowym tego genu.

1. Charakterystyka regionu promotorowego genu dnaA Streptomyces – białko DnaA jako represor ekspresji własnego genu

          Charakterystyczny skład boksów w regionie promotorowym genu dnaA jest istotny ze względu na oddziaływania białko–DNA. Dla kooperatywnego wiązania mniejsze znaczenie ma zgodność z konsensem rozpoznawanych sekwencji, a większe odległość między nimi i ich orientacja. Określony układ przestrzenny rozpoznawanych sekwencji umożliwia oddziaływanie cząsteczki białka związanej do jednego boksu z cząsteczką białka wiążącą się do sąsiedniego boksu.

2.     Białko DnaA jako represor i aktywator

          Funkcja białka DnaA jako represora czy aktywatora jest głównie uzależniona od wzajemnego układu boksów DnaA a nie od ich sekwencji. W analizowanym regionie promotorowym decydujące znaczenie dla represji lub aktywacji ma położenie i/lub orientacja „słabego” boksu. Jest to tym bardziej ciekawe, że jak wykazały badania in vitro (SPR, DnaseI footprinting) boks ten jako samodzielny nie jest wiązany przez białko DnaA.

          Wyniki tych badań zostały częściowo zawarte w manuskrypcie pracy pt.: „Structure and regulation of the dnaA promoter region structure of three Streptomyces species”, przyjętej do druku w Mol. Gen. Genet.

Wykonawcy: mgr D. Jakimowicz, mgr inż. B. Lis

Publikacja nr 114

Temat nr 37

Mechanizm działania nowych azakarbazoli o właściwościach cytotoksycznych i przeciwnowotworowych – pochodne poliaminowe indolo[2,3-b]chinoliny jako potencjalne inhibitory topoizomeraz DNA

Laboratorium Biologii Molekularnej Mikroorganizmów,
kierownik: doc. dr Jolanta Zakrzewska-Czerwińska

          Badania nad zależnością pomiędzy aktywnością cytostatyczną a strukturą inhibitorów topoizomeraz skłaniają większość zespołów badawczych do poszukiwań nowej kategorii połączeń – związków hybrydowych. Związki tego typu skonstruowane są z dwóch różnych podjednostek: interkalującej i wiążącej mniejszą bruzdę helisy DNA. Związki o charakterze interkalatorów, jak i fragmenty wiążące mniejszą bruzdę helisy DNA wykazują (wynikającą z ich natury chemicznej) specyficzność w wiązaniu się do określonej sekwencji DNA. Utworzony z nich hybryd może (choć nie musi) wykazywać sekwencjo-selektywność wiązania się do DNA odmienną od fragmentów składowych.

          Zastosowanie metod modelowania molekularnego przy projektowaniu i two­rzeniu połączeń hybrydowych pozwala na zracjonalizowanie działań mających na celu zwiększenie efektywności działania cytostatyku (antybiotyku). Modelowanie mole­kularne pozwala na ilościowy opis zjawisk pozostających do tej pory domeną „intuicji chemicznej”. Za pomocą modelowania można opisać jakość oddziaływań pomiędzy ligandem i receptorem w rozbiciu na poszczególne składowe (oddziaływania elektro­statyczne, hydrofobowe, Van der Waals’a etc.). W przypadku inhibitorów topo­izomeraz DNA receptorem jest dwuniciowy fragment helisy DNA o zdefiniowanej sekwencji nukleotydowej.

          Prowadzone od wielu lat badania nad zależnością między aktywnością a struk­turą azakarbazoli zaowocowały wyselekcjonowaniem 5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3--b]chinoliny (interkalatora wykazującego aktywność cytostatyczną w stężeniu 1 mM, hamującego aktywność DNA topoizomerazy II), jako podstawowego składnika cząs­teczki hybrydowej. Związek ten posłużył jako element interkalujący hybrydy, drugi element stanowił fragment poliaminy odpowiedzialny za wiązanie mniejszej bruzdy DNA. Podjęte badania miały na celu ustalenie optymalnej wielkości podstawnika poliaminowego oraz miejsca jego przyłączenia do cząsteczki indolo[2,3-b]chinoliny.

          Wyznaczono doświadczalnie (stosując technikę footprinting) sekwencjo-selektywność wiązania się do DNA związków wiodących (interkalatorów) z serii 5H- (DiMIQ) i 6H- (I-563). Związki te wiązały się do sekwencji 5’-TGCTA-i-ACGCA rozpoznając  po trzy pary zasad w górę i w dół nici DNA od miejsca interkalacji (i).

          Na podstawie badań footprinting, stosując technikę modelowania molekular­nego stworzono wirtualny model kompleksu interkalacyjnego. Stosując metodę pól siłowych wyznaczono z puli proponowanych układów te, które charakteryzowały się najniższą energią (a więc najstabilniejsze i preferowane z energetycznego punktu widzenia). Preferowanym miejscem interkalacji okazała się również sekwencja 5’-TGCTAACGCA. Uzyskano zatem zgodność eksperymentu z modelem teoretycznym.

          Z modelu obrazującego ułożenie przestrzenne interkalatora w niszy DNA wynika, że ewentualne podstawienie układu indolo[2,3-b]chinoliny w pozycjach C-2 i/lub C-9 spowoduje skierowanie tych podstawników w stronę większej bruzdy helisy (co stwarza większą dowolność w projektowaniu rodzaju i rozmiaru podstawników), natomiast podstawniki w pozycji N-5 lub N-6 zwrócone będą w stronę mniejszej bruzdy (co powoduje ograniczenie rozmiaru podstawnika zgodnie z wymogami budowy związków typu minor-groove binders).

          Potwierdzenie „poprawności pracy” stworzonego modelu wirtualnego wykaza­no doświadczalnie. Z serii pilotowych pochodnych hybrydowych 6H-indolo[2,3--b]chinoliny tylko te, które zawierały łańcuch amino-alkilo-aminowy, a więc spełniały warunki narzucone typem budowy minor-groove binders (jako analogi biogennych amin), wykazywały cytotoksyczność oraz zdolność do hamowania aktywności topo­izomerazy II.

          Wyniki badań były prezentowane na Multidyscyplinarnej Konferencji Nauki o Leku w Muszynie i Pierwszym Krajowym Kongresie Biotechnologii we Wrocławiu.

Wykonawcy: doc. dr W. Peczyńska-Czoch, dr J. Osiadacz

Publikacje nr: 71 i 119

Temat nr 38

Rola genu p53 w patogenezie nowotworów. Zaburzenia ekspresji genu p53 w nowotworach dziecięcych

Laboratorium Biologii Molekularnej Mikroorganizmów,
kierownik: doc. dr Jolanta Zakrzewska-Czerwińska

          Uważa się, że mutacje genu supresorowego p53 są przyczynowo związane z rozwojem nowotworów powstałych w wyniku ekspozycji na kancerogeny (raki płuca, pęcherza, skóry). W rozwoju nowotworów dziecięcych, np. mięsaków tkanek mięk­kich i kości, a także nowotworów układu hematologicznego ważną rolę wydają się odgrywać spontaniczne mutacje genu p53. W innych rodzajach nowotworów dzie­cięcych, takich jak potworniak, nerwiak niedojrzały lub guzy Wilmsa mutacje genu p53 są wykrywane bardzo rzadko, natomiast poziom prawidłowego białka p53 jest często bardzo wysoki. Rola p53 w etiologii i patogenezie tych nowotworów nie została dotąd poznana.

          We wcześniejszych badaniach prowadzonych w IITD nad mutacjami p53 w guzach dziecięcych wykazano, że częstość mutacji p53 w tych nowotworach jest niska w populacji polskiej. Badania prowadzone w roku 1999 były kontynuacją tych badań i ich celem było zbadanie zaburzeń ekspresji genu p53 w nowotworach dziecięcych.

          Wycinki nowotworów uzyskano z Kliniki Chirurgii Dziecięcej AM we Wrocławiu. Badania wykonano techniką Western bloting na 67 wycinkach nowo­tworów i 12 próbkach zmian przedrakowych lub nienowotworowych. Białko p53 na blotach wykrywano przeciwciałem D0-1, które rozpoznaje epitop na N-końcu białka, stąd reaguje z prawidłowym p53 i muteinami. Ilość białka p53 na blotach określano densytometrycznie za pomocą programu ScanPack 3.0.

          W badanej serii guzów około 1/3 stanowiły mięsaki tkanek miękkich, 19% to guzy kości, 16% – guzy nerek, 13% – guzy zarodkowe, 9% – nerwiak niedojrzały, 6% – nowotwory układu krwiotwórczego i 4% – inne nowotwory. Białko p53 wykryto w 40 wycinkach nowotworów spośród 67 badanych (59,7%), w tym w 10 (14,9%) guzach poziom p53 był bardzo wysoki. Tylko dwa nowotwory, w których wykryto mutacje genu p53, mięsaki tkanek miękkich – PW23 i PW30 można było analizować pod względem poziomu białka p53. Zgodnie z doniesieniami literaturowymi, w tych próbkach wykazano bardzo wysoki poziom p53. Ogólnie, w mięsakach tkanek miękkich obecność białka p53 wykazano tylko w 8/22 badanych, zaś w mięsakach kości – w 9/13 badanych.

          W badanej serii guzów, obecność białka p53 wykazano najczęściej, w nowo­tworach nerek (80% dodatnich próbek) i w guzach zarodkowych (78%). Nieco mniejszy odsetek dodatnich wycinków obserwowano w przypadku nerwika zarodko­wego (67%). Rola p53 w patogenezie tych nowotworów jest prawdopodobnie różna.

Wykonawcy: dr Ł. Fiszer-Maliszewska, mgr B. Wojciechowska, i K. Korsak – student V roku Biotechnologii UW

Zakład Immunologii Klinicznej

Temat nr 39

Polimorfizm HLA-A*02 w populacji polskiej

Laboratorium Immunologii Tkankowej, p.o. kierownika: dr Beata Nowakowska

          HLA-A2, jeden z pierwszych opisanych antygenów zgodności tkankowej jest najczęściej występującą cząsteczką w większości populacji na świecie. Gen ten wys­tępuje z częstością 25–30 % w populacjach kaukazoidalnych, w tym z częstością 30% w populacji polskiej, z nieco niższą częstością 10–20% w populacjach afrykańskich i u australijskich aborygenów. Brak antygenu HLA-A2 obserwowano jedynie wśród plemion górskich Papui-Nowej Gwinei.

          Zastosowanie metod biologii molekularnej i możliwość określania alleli genu, wykazało, że jest to również jeden z najbardziej polimorficznych genów zgodności tkankowej. Według ostatnich danych istnieją 32 różne podtypy, możliwe do zidenty­fikowania na poziomie DNA, a określanych dotychczas jako jeden antygen A2.

          Polimorfizm stwierdzany w podtypach  HLA-A2 ma znaczenie funkcjonalne, dzięki różnym możliwościom wiązania określonych peptydów i ich prezentowania limfocytom T. Z pierwszych przeprowadzonych badań wynikało również, że rozkład alleli genu A*02 może być różny w różnych populacjach.

          Celem podjętych badań było wstępne określenie rozkładu alleli antygenu HLA-A2 w populacji Polski południowo-zachodniej i wstępna analiza danych pod kątem występowania poszczególnych wariantów w określonych haplotypach.

          W badanej próbie populacyjnej z 29 możliwych do określenia alleli stwierdzono obecność pięciu podtypów. Powszechnie występującym, z częstością 88,3%, był allel A*0201. Allele A*0202, *0205, *0207 i *0216 wystąpiły w pojedynczych przy­padkach. W populacjach kaukazoidalnych, w tym w polskiej, przeważał allel A*0201, występujący z częstością 80–96%. Allel A*0201 obecny jest też w populacjach Afryki wschodniej i zachodniej Jednakże w populacjach afrykańskich z porównywalnie wysoką częstością występuje allel A*0202, bardzo rzadki w innych grupach etnicznych.

          W badanym przez nas materiale prawdopodobnie ze względu na jego niewielką liczebność, nie stwierdziliśmy obecności żadnego allelu zerowego. Nie można  było również wyodrębnić określonego haplotypu, w którym allel ten występowałby częściej z pewnymi antygenami loci B i C.

          Wyniki badań mają znaczenie poznawcze (dane dla populacji polskiej), a także znaczenie praktyczne nie tylko w przypadku poszukiwań dawcy niespokrewnionego w przeszczepach szpiku, ale również w badaniach dotyczących związku antygenu HLA z chorobami.

Wykonawcy: dr M. Szuszkiewicz, tech. D. Tracz, tech. A. Kornatowska

Temat nr 40

Test mieszanej hodowli limfocytów w doborze dawca - biorca przeszczepu szpiku.

Analiza wyników otrzymanych w układach: genotypowo zgodny dawca rodzinny, alternatywny dawca rodzinny i dawca niespokrewniony

Laboratorium Immunologii Tkankowej, p.o. kierownika: dr Beata Nowakowska

          Jednym z zasadniczych problemów w transplantacji szpiku jest wysokie ryzyko wystąpienia reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvH). Dlatego istotnym kryterium w doborze dawcy przeszczepu jest stopień zgodności w antygenach HLA między dawcą a biorcą. Test MLC jest badaniem pozwalającym „in vitro” analizować zakres zdolności do proliferacji komórek dawcy i/lub biorcy w odpowiedzi na różnice antygenowe występujące na komórkach partnera przeszczepu. Sygnał prowadzący do aktywacji i proliferacji limfocytów T pochodzi głównie od polimorficznych determinant cząsteczek HLA klasy II. Są to głównie cząsteczki locus DR, w mniejszym stopniu antygeny locus DP, a najmniejszą zdolność stymulacji posiadają cząsteczki locus DQ, choć stwierdzono, że różnice w zakresie DQB1 mogą indukować klony komórek cytotoksycznych.

          Test mieszanej hodowli limfocytów (MLC) jest stosowany w końcowej fazie poszukiwań dawcy. Celem przedstawionej pracy jest porównanie i analiza wartości parametrów służących do oceny odpowiedzi komórkowej, w tym głównie wartości relatywnej odpowiedzi, otrzymanych w testach dla par dawca – biorca przeszczepu szpiku w różnych układach zgodności tkankowej. Analiza taka powinna być pomocna w prawidłowej ocenie i interpretacji otrzymywanych wyników, szczególnie w kierun­ku reakcji GvH. Aby otrzymać prawdziwe i powtarzalne wyniki testów MLC należy założyć odpowiednie kontrole i dobrać wskaźniki służące do interpretacji wyników.

          Mimo dużych różnic osobniczych, występujących w poszczególnych testach, a dotyczących wyników wartości kontrolnych, tzn. średnich wartości reakcji auto­logicznej, wartości referencyjnej i indeksu stymulacji, uzyskanych dla różnych ukła­dów zgodności między biorcą i dawcą, ich rozkład i średnie wartości nie wykazują znamiennych statystycznie różnic. Powyższe dane świadczą o stabilności testu, który zawsze wykonywany jest według identycznej procedury i którego wyniki poddawane są analizie dokładnie w ten sam sposób.

          Wyraźne i statystycznie istotne różnice występują natomiast dla wskaźnika relatywnej odpowiedzi (RR). Wskaźnik ten odzwierciedla stopień pobudzenia ko­mórek odpowiadających, wynikły z niezgodności między dawcą a biorcą przeszczepu w zakresie antygenów HLA klasy II. Różnice między średnimi wartościami RR i różnice rozkładów wartości RR dla poszczególnych grup par dawca–biorca, są statystycznie istotne na poziomie p<0,001. Nie można jednakże wyraźnie i w sposób jednoznaczny rozgraniczyć wyników otrzymanych dla różnych grup. Rozkłady wartości wskaźnika RR w różnym stopniu zachodzą na siebie. Na taki stan rzeczy mogą wpływać różne czynniki, w tym: brak pobudzenia przy określonych niezgodnościach (głównie w locus DP), zgodność w szerokich haplotypach o typie konserwatywnym, efekt NIMA.

          Dla dawcy rodzinnego, genotypowo dobranego 93% wyników wskazuje na pełną zgodność w zakresie genów regionu D, podczas gdy jedynie 50% wyników dla dobranego dawcy niespokrewnionego można uznać za ujemne.

          Podsumowując, należy zauważyć, że wyniki otrzymywane w testach MLC dobrze odzwierciedlają stopień zgodności, w zakresie antygenów HLA klasy II, między dawcą a biorcą przeszczepu szpiku. Badanie to przy rygorystycznie stoso­wanym protokole i odpowiednio kontrolowane może dostarczyć użytecznych informacji .

Wykonawcy: mgr W. Niepiekło, mgr A. Pietkiewicz

Temat nr 41

Wykorzystanie metod hybrydyzacji in situ (FISH) w celu określenia chimeryzmu potransplantacyjnego u pacjentów po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego

Laboratorium Immunologii Klinicznej, kierownik: prof. dr Andrzej Lange

            Pełny i trwały chimeryzm potransplantacyjny stanowi podstawę weryfikacji skuteczności allotransplantacji i pozwala na rokowanie odnośnie wznowy choroby. Stosowane dotąd metody wykorzystujące badanie wzoru mikrosatelitarnego są czaso­chłonne i wymagają wykonania elektroforezy na żelu sekwencyjnym. Badanie grup krwi nie zezwala na identyfikację chimeryzmu w populacji leukocytów. Hybrydyzacja in situ łączy w sobie czułość detekcji sond molekularnych z identyfikacją mikroskopo­wą obrazu. Można więc zidentyfikować pochodzenie komórek w badanej populacji od dawcy lub biorcy. Zastosowanie metod hybrydyzacji in situ (FISH) w celu określenia obecności chromosomów X i Y u biorcy przeszczepu ma istotne znaczenie w przypadkach gdy dawca i biorca są odmiennej płci. Metoda FISH pozwala na dokonanie analizy jakościowej i liczbowej badanych komórek. Użycie a-satelitarnych sond DNA dla identyfikacji chromosomów X i Y pozwala na wykorzystanie metody FISH w jądrach interfazowych, dzięki temu możemy wykonać szybką i precyzyjną analizę obecności chromosomów X i Y. Identyfikacja obecności chromosomów dawcy w badanym materiale biorcy przeszczepu (krew lub szpik) pozwala na określenie tempa odnowy hematologicznej oraz na monitorowanie tego procesu.

          Badaniem objęto 15 pacjentów po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego, dla których dawca był odmiennej płci. Zbadano 31 preparatów krwi obwodowej lub szpiku w czasie od +11 dnia do +1000 dnia po alloprzeszczepie szpiku. Przeszczep szpiku wykonano z powodu chorób rozrostowych układu krwiotwórczego takich jak: CML u 5 chorych, ALL u 3 chorych, AML u 2 chorych i jeden z powodu MDS. W przypadkach anemii wykonano 2 przeszczepy z powodu SAA i jeden w FA. We wro­dzonym niedoborze odpornościowym SCID został wykonany 1 przeszczep. U 11 cho­rych dokonano przeszczepu od dawcy rodzinnego (brat lub siostra) zgodnego w obu haplotypach, u 3 chorych miał miejsce przeszczep od alternatywnego dawcy natomiast u 1 chorej przeprowadzono przeszczep od dawcy niespokrewnionego.

Do identyfikacji chromosomów X i Y wykorzystano zestaw Chromoprobe-I (Cytocell, Banbury, Anglia) zawierający specyficzne, a-satelitarne sondy DNA, umieszczone na jednym szkiełku, identyfikujące w tej samej komórce miejsca centromerowe dla chromosomów X locus DXZ1 i Y locus DYZ1. Sondy X znakowane były FITC, natomiast sondy Y związano z Cy3. Chimeryzm poprzeszczepowy oznaczono również metodą krótkich fragmentów polimorficznych DNA (STR-PCR, short tandem repeat) z wykorzystaniem odpowiednich informatywnych markerów mikrosatelitarnych znako­wanych fluorochromem.

          Analiza przeprowadzona metodą FISH we wczesnym okresie po przeszczepie szpiku (do +30 dnia) wykazała, że wśród 5 pacjentów, u których przeprowadzono badania w tym czasie, u 3 stwierdzono mieszany chimeryzm wyrażony obecnością dwóch populacji komórek, resztkową biorcy i przeważającą dawcy, w zależności od płci dawcy. W tych sytuacjach udział komórek biorcy wynosił jedynie od 0,12 do 0,9%. W dwóch przypadkach już w pierwszym okresie po przeszczepie był obecny pełen chimeryzm. U 3 z 5 chorych badanych do +30 dnia zbadano chimeryzm metodą STR. U dwóch chorych, w tym u jednego z pełnym a u drugiego z niepełnym chimeryzmem wynik STR był analogiczny jak w metodzie FISH. Wyjątek stanowił UPN294, gdzie mieszany chimeryzm <1% w metodzie FISH nie został potwierdzony metodą STR. W późniejszym okresie od +30 do +45 dnia po przeszczepie metodą FISH zbadano preparaty pobrane od 5 pacjentów. W jednym przypadku obserwowano mieszany chimeryzm, gdzie udział komórek biorcy wynosił 0,65%. U jednej chorej, która otrzymała przeszczep od niespokrewnionego dawcy, stwierdzono obecność kariotypu XO, natomiast u pozostałych pacjentów stwierdzono wyłącznie obecność komórek dawcy. Metodą STR zbadano 2 próbki z tego okresu. W sytuacji, gdzie metodą FISH stwierdzono kariotyp XO w metodzie STR zidentyfikowano chromosom Y nie uwidoczniony metodą FISH, w drugim przypadku wynik badania wykazywał całkowity chimeryzm, podczas, gdy w badaniu FISH obserwowano mieszany kariotyp <1% komórek biorcy (UPN 294, +31dni). Dalsze obserwacje prowadzone do 100 dnia po przeszczepie, kiedy u pacjenta następuje całkowita odnowa hematologiczna i w późniejszym okresie (w badanej grupie do 1000 dnia po przeszczepie), łącznie w 20 preparatach komórek krwi lub szpiku wykazały całkowity chimeryzm w 18 prób­kach u pacjentów w wynikach uzyskanych metodą FISH i mieszany kariotyp u dwóch chorych. Analizowane metodą STR 14 próbek wykazało całkowity chimeryzm w 12 preparatach i mieszany w dwóch sytuacjach. W tych dwóch przypadkach wyniki uzyskane w metodzie FISH (>6% komórek biorcy) i metodą STR były zgodne. Zastosowanie obu metod FISH i STR w ocenie 14 preparatów, po +45 dniu po przeszczepie, wykazało pełną zgodność analizy oboma metodami.

Łącznie w celu określenia chimeryzmu obie metody wykorzystano u 13 pacjentów w badaniu 20 próbek krwi lub szpiku. W 17 preparatach z pełnym chimeryzmem wyniki uzyskane w metodzie FISH i STR były podobne, w 3 natomiast, pobranych od dwóch chorych, wyniki badań były odmienne (UPN294, UPN302). W pierwszej sytuacji metoda FISH okazała się bardziej czuła niż metoda STR, ponieważ pozwala na wykrycie mikrochimeryzmu w przypadkach, gdy udział komórek biorcy wynosi <1%. W drugim przypadku metodą STR określono obecność chromosomu Y, którego nie wykazano metodą FISH. Mieszany chimeryzm w pierwszym okresie po przeszczepie obserwowano u pacjentów, u których nie było klinicznych objawów GvH. W pozostałych przypadkach u 5 chorych nie obserwowano klinicznych zmian odpowia­dających GvH, u 4 pacjentów były zmiany 1 stopnia, u jednej pacjentki zmiany odpowiadały 2 stopniowi i u jednego chorego 4 stopniowi. Ponadto mieszany chimeryzm pojawił się w późniejszym czasie po przeszczepie (+100 i +117 dnia), co może wskazywać na istnienie dwóch populacji komórek, w sytuacji, gdy komórki biorcy nie są komórkami nowotworowymi, lub na wznowę procesu nowotworowego. U tych chorych nie stwierdzono objawów GvH.

          Przedstawione sprawozdanie obejmuje porównawcze badania 15 chorych, u których wykonano przeszczep od dawców odmiennej płci (obecna była bariera płciowa pomiędzy dawcą a biorcą). Pozwoliło to na porównanie czułości metody STR w detekcji chromosomów X,Y z metodą FISH. W metodzie FISH czułość metody ograniczona jest możliwością oglądnięcia odpowiednio dużej liczby komórek w mikroskopie fluorescen­cyjnym i zanik fluorescencji w czasie. W metodzie STR barierą jest ilość DNA, którą nakładamy na ścieżkę żelu sekwencyjnego. Niezbędna jest graniczna ilość DNA, która w formie amplifikatów identyfikowalna jest na żelu sekwencyjnym. Porównanie metody FISH, której próg aktualnej czułości detekcji  jest określony liczbą ocenionych komórek, do metody STR przy progowej ilości DNA pozwoli na określenie podobieństwa czułości detekcji obydwu metod.

          Otrzymane wyniki badań były prezentowane na IV Kongresie Polskiego Towarzystwa Transplantacyjnego we Wrocławiu i podczas spotkania beneficjantów programu „DIAMOL” w Poznaniu.

Wykonawcy: dr A. Klimczak, dr B. Wysoczańska, mgr inż. D. Dłubek,
lek. med. J. Dybko, A. Grzyb

Temat nr 42

Zastosowanie metody F-SSCP (Fluorescent Single Strand Conformational Polymporphism) do badania sprzężeń w obrębie genów TNFa i TNFb
i ich roli w kształtowaniu odpowiedzi immunologicznej

Laboratorium Immunologii Klinicznej, kierownik: prof. dr Andrzej Lange

Wiele grup badawczych poświęciło uwagę badaniom zależności pomiędzy polimorfizmem genów TNFa i TNFb a ich produkcją in vitro. Już w roku 1991 w publikacji, w której opisano polimorfizm pierwszego intronu genu TNFb stwierdzono podwyższoną produkcję TNFb w hodowlach komórkowych, związaną z jednym z alleli TNFB i obniżoną w przypadku drugiego allelu. Ze względu na swoje umiejsco­wienie w promotorze genu, polimorfizm TNFa wydaje się być bardzo atrakcyjny dla badaczy. W badaniach modelowych na liniach komórkowych wykazano, że pewne allele TNFA zwiększają potencjał transkrypcyjny genu TNFa. Udało się też pokazać różnice w produkcji TNFa w hodowlach komórek izolowanych od osób posiadających różne allele TNFA. Nasze prace potwierdzają to na poziomie mRNA w badaniach z zastosowaniem półilościowej metody RT-PCR.

W świetle najnowszych odkryć stwierdzających „gęste” występowanie poli­morfizmu w obrębie promotora genu TNFa, gdzie znajduje się wiele potencjalnych miejsc wiązania jądrowych czynników transkrypcyjnych, idea badania sprzężeń w tym regionie wydaje się być w pełni uzasadniona. Badaniami naszymi objęliśmy poli­morfizm w regionie ±400 par zasad od punktu startu transkrypcji.

               W ramach tematu zaprojektowane zostały primery umożliwiające amplifikację polimorficznych fragmentów genów zawierających pozycje polimorficzne. Wyznako­wanie jednego z każdej pary primerów barwnikiem fluorescencyjnym pozwala na odczyt żelu SSCP w aparacie ABI Prism DNA Sequencer 377. Metoda SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism – polimorfizm konformacyjny jednoniciowego DNA) – to metoda pozwalająca na rozdział elektroforetyczny cząsteczek DNA róż­niących się jednym lub więcej niż jednym nukleotydem. Cząsteczki te, w specjalnych warunkach stwarzanych w metodzie, formują różne struktury trzeciorzędowe, a to wpływa na prędkość ich migracji podczas elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Sekwencjonowanie amplifikatów pochodzących od osobników homozygotycznych (jeden prążek w SSCP) umożliwia przyporządkowanie wzoru prążków w SSCP odpowiedniemu rozszerzonemu haplotypowi TNFA i TNFB spośród badanych.

          Zastosowanie metody SSCP umożliwia badanie rozszerzonych haplotypów i ich typowanie w jednej reakcji PCR i w jednym żelu elektroforetycznym.

Wykonawcy: mgr inż. C. Świder, mgr I. Kryczek, lek. med. B. Zając

Temat nr 43

Wykorzystanie elutriacji (CCE) w przeszczepach allogenicznych

Opracowanie metody obróbki preparatu komórek jednojądrowych
uzyskanych po mobilizacji G-CSF (PBPC) dla allotransplantacji drogą aferezy z krwi obwodowej

Laboratorium Immunologii Klinicznej, kierownik: prof. dr Andrzej Lange

Przeszczepy komórek macierzystych wyizolowanych z krwi obwodowej zawie­rają około 10 razy więcej limfocytów T niż przeszczepy ze szpiku, co znacznie zwiększa ryzyko wystąpienia ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. Celem naszej pracy było optymalne przygotowanie (eliminacja GvHD bez eliminacji GvL i ryzyka nieprzyjęcia przeszczepu), pod względem składu komórkowego, pre­paratu PBPC do alternatywnego przeszczepu allogenicznego, przez opracowanie metody oczyszczania preparatów komórek macierzystych zmobilizowanych do krwi obwodowej pobranych od rodzinnych dawców alternatywnych. Wybraną metodą usuwania z preparatu limfocytów T odpowiedzialnych za inicjację reakcji GvH było przeciwprądowe wirowanie z elutriacją (CCE – Counterflow Centrifugal Elutriation). Poza tym obserwowano u pacjentów poddanych przeszczepowi odnowę hemato­logiczną, immunologiczną oraz chimeryzm poprzeszczepowy.

          W roku 1999 wykonano przeszczep z zastosowaniem elutriacji u dwóch pacjentów. Przeszczepy wykonano od alternatywnych dawców rodzinnych (antygeny zgodności tkankowej HLA biorcy i dawcy przeszczepu oznaczono za pomocą analizy genomowego DNA metodami: PCR-SSP i PCR-SSO). Komórki macierzyste szpiku mobilizowano do krwi obwodowej  za pomocą G-csf i izolowano drogą aferezy w separatorze komórkowym Cobe Spectra (CS 300). Jeden przeszczep wykonano u półtorarocznego dziecka ze złożonym wrodzonym niedoborem odporności (SCID), dawcą komórek hematopoetycznych był ojciec. Był to powtórny przeszczep u tego pacjenta. Drugi zabieg dotyczył dorosłego mężczyzny z ostrą białaczką mielo­blastyczną. Dawcą przeszczepu była w tym przypadku siostra chorego.

          W celu usunięcia z materiału przeszczepowego limfocytów T wykorzystywano metodę przeciwprądowego wirowania z elutriacją (CCE). Jest to stosunkowo nowa, wydajna i szybka, metoda polegająca na separacji komórek w oparciu o ich wielkość i gęstość. W wyniku separacji (różne prędkości przepływu buforu płuczącego) otrzy­mywane są frakcje różniące się między sobą wielkością, morfologią i właściwościami immunologicznymi komórek. Materiał przeszczepowy komponowany jest z frakcji pozbawionej całkowicie limfocytów T i wzbogaconej w komórki hematopoetyczne.

      Przeprowadzono dziesięć elutriacji do allogenicznego przeszczepu komórek hematopoetycznych u dwóch pacjentów. U dawcy dla dziecka ze SCID wykonano jedną leukoferezę i dwie elutriacje, przy czym wystarczająca dla dokonania przeszczepu okazała się jedna elutriacja, natomiast materiał pochodzący z drugiej elutriacji zamrożono w ciekłym azocie. Dawczyni dla pacjenta z AML została poddana trzykrotnej leukoferezie i otrzymane preparaty oczyszczono z limfocytów T podczas ośmiu elutriacji.

          Przeszczepiono następujące frakcje: (1) frakcja 140 ml/min (UPN 289) z pierwszej elutriacji, zawierająca wyższy odsetek (konsekwencją czego była większa liczba) komórek CD34+, liczba komórek CD34+ z jednej elutriacji była w przypadku dziecka wystarczająca do dokonania transplantacji; (2) frakcja „rotor off” (UPN 316), przetoczono skumulowane frakcje „rotor off” elutriacji wykonanych w ciągu trzech dni (z pierwszego i drugiego preparatu PBPC po trzy elutriacje, z trzeciego preparatu PBPC – dwie).

          Następnym etapem badań była obserwacja rekonstytucji hematologicznej i immunologicznej u chorych poddanych allogenicznemu przeszczepowi komórek hematopoetycznych z CCE. Fenotypowanie limfocytów krwi obwodowej w trakcie odnowy immunologicznej wykonywano z użyciem metod cytometrii przepływowej.

Istotnym elementem obserwacji pacjentów po zabiegu było badanie chimeryzmu poprzeszczepowego. Wykorzystywano metodę krótkich polimorficznych fragmentów mikrosatelitarnych (STR).

          Wykorzystanie metody CCE do obróbki materiału przeszczepowego pozwala na wystarczające, w celu zapobieżenia reakcji GvH, usunięcie limfocytów T i uzys­kanie odpowiedniej liczby komórek CD34+ odpowiedzialnych za szybką i trwałą odnowę hematologiczną i immunologiczną po przeszczepie.

Wykonawcy: dr A. Łaba, mgr inż. D. Dłubek, dr B. Wysoczańska, lek. med. J. Dybko

Temat  nr 44

Porównanie zdolności fibroblastów i splenocytów myszy do prezentacji antygenu

Laboratorium Immunogenetyki, kierownik: doc. dr Piotr Kuśnierczyk

          Porównano reakcję proliferacyjną splenocytów myszy BALB/c (H-2^d) w odpo­wiedzi na alloantygen I-Ab prezentowany przez limfocyty myszy B6 (H-2^b) oraz przez mysie fibroblasty Ltk-/- transfekowane I-A^b. Obserwowano proliferację limfocytów BALB/c w odpowiedzi na limfocyty B6, tłumioną przez toksyczne działanie wzrastających dawek mitomycyny C, natomiast fibroblasty, nawet nie traktowane mitomycyną, nie stymulowały limfocytów BALB/c. Porównano również odpowiedź limfocytów myszy B6 nieimmunizowanych lub immunizowanych peptydem Ep z odpowiedzią komórek hybrydomy T anty-Ep na antygen Ep prezentowany przez fibroblasty transfekowane cząsteczką I-A^b z kowalencyjnie związanym Ep. Limfocyty mysie odpowiadały na antygen Ep proliferacją, lecz znacznie słabiej niż komórki hybrydomy. Tylko w jednym przypadku ( w 4. dniu hodowli limfocytów pobranych w 6 dni po immunizacji) obserwowano odpowiedź porównywalną z odpowiedzią hybrydomy. Wyniki te świadczą o tym, że z powodu braku cząsteczek kostymu­lujących na fibroblastach, komórki te, nawet transfekowane cząsteczką klasy II ze związanym antygenem, są gorszymi komórkami prezentującymi antygen dla limfocytów od myszy nieimmunizowanych, niż dla limfocytów od myszy immu­nizowanych i komórek swoistej hybrydomy.

          Ponadto, poza planem, wykonano następujące badania:

A)   Sprawdzono wpływ nonapeptydu z białka p24^gag HIV-1 na ekspresję HLA-C na powierzchni komórek HLA-Cw3 i stwierdzono, że peptyd ten nie ma wpływu w porównaniu z oktapeptydem, podwyższającym ekspresję HLA-C;

B)   Porównano ekspresję HLA na dwu limfoblastycznych podliniach komórkowych wyprowadzonych z linii CCRF/CEM z ekspresją HLA na komórkach linii bez defektu HLA i stwierdzono, że była ona (poza HLA-A) niewykrywalna z teście mikrocytotoksycznym, co potwierdziły badania cytofluorymetryczne z zestawem przeciwciał monoklonalnych;

C)   Zbadano wpływ interferonu gamma na ekspresję HLA na komórkach limfo­blastycznej linii HAJ mającej defekt ekspresji genów HLA klasy II i niską ekspresję antygenów klasy I; cytokina ta powodowała podwyższenie ekspresji antygenów klasy I, lecz nie przywracała ekspresji antygenów klasy II.

Wykonawcy: mgr I. Nowak, mgr M. Prussak, mgr B. Pochroń, dr A. Lis-Nawara, tech. D. Latańska

Zakład Immunologii Chorób Zakaźnych

Temat nr 45

Struktura głównego glikolipidu Rothia dentocariosa

Laboratorium Mikrobiologii Lekarskiej i Laboratorium Mikologii,
kierownik: doc. dr hab. Andrzej Gamian

          Glikolipid główny będący markerem aktynobakterii Rothia dentocariosa, znany był dotąd jako dimannozylodigliceryd. Za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) określono jego szczegółową budowę. Okazało się, że jest on dimannozylodiacylomonoglicerydem, gdyż jeden z kwasów tłuszczowych połą­czony jest z węglem pierwszym glicerolu, natomiast drugi występuje w pozycji C6 wewnętrznej reszty dimannozydu.

          Interesujące jest, że identyczny strukturalnie glikolipid wykryto uprzednio w komórkach promieniowców termofilnych (Saccharopolyspora) wywołujących zew­nątrzpochodne, alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych, znane jako „płuco rolnika”. Markery lipidowe o takiej samej charakterystyce chromatograficznej znale­ziono także w innych filogenetycznie pokrewnych taksonach rodziny Micrococcacee (Micrococcus, Stomatococcus, Arthrobacter).

          Dystrybucja i ustalenie struktury głównego glikolipidu tych mikroorganizmów, których naturalnym środowiskiem jest gleba, może przyczynić się do trudnej do usta­lenia etiologii endogennych zakażeń promieniczopodobnych i alergicznego zapalenia pęcherzyków płucnych, oraz wyjaśnienia nie rozwiązanych ciągle problemów takso­nomicznych Rothia dentocariosa. Uzyskane wyniki dowodzą także, że zanika granica dotychczasowego podziału bakterii na chorobotwórcze i niechorobotwórcze. Biolo­giczna rola drobnoustrojów związana jest bowiem z ich adaptacją do środowiska, w tym także do warunków in vivo, ze szczególnym uwzględnieniem zdolności organizmów wyższych do odpowiedzi odpornościowej.

          Wyniki badań mają znaczenie poznawcze z możliwością praktycznego wyko­rzystania poznanego glikolipidu jako markera immunodiagnostycznego.

Przygotowano do druku pracę pt.: „Structure of the major glycolipid from Rothia dentocariosa” – I. Ekiel, H. Mordarska, A. Grzegorzewicz, M. Paściak, A. Gamian.

Wykonawcy: dr M. Paściak, mgr A. Grzegorzewicz, prof. dr H. Mordarska

Temat nr 46

Badania glikolipidów promieniowców w ramach programu „Epidemiologia nokardioz i innych tlenowych promienic”

Laboratorium Mikrobiologii Lekarskiej i Laboratorium Mikologii,
kierownik: doc. dr hab. Andrzej Gamian

          Badania epidemiologiczne nokardioz i zakażeń innymi tlenowymi promieniow­cami są nieliczne. Nie jest znana częstość zachorowań na aktynomicetozy wywo­ływane przez promieniowce tlenowe (nokardiozy i zakażenia nokardiozopodobne) i beztlenowe (promienica oraz infekcje promieniczopodobne). Jednakże nowsze dane wskazują, że stanowią one coraz większy problem medyczny. Dotyczy to zwłaszcza dysfunkcji układu odpornościowego i terapii supresyjnej towarzyszącej przeszcze­pianiu narządów. Trudności diagnostyczne powodują prawdopodobnie zaniżenie częstości ich rzeczywistego występowania. Nasz Zakład został włączony do europej­skiego programu badań epidemiologicznych nokardioz i chorób wywoływanych przez inne promieniowce. W ramach realizacji projektu przygotowano odpowiednią ankietę, która została opublikowana w pięciu krajowych czasopismach medycznych, opraco­wano listę laboratoriów i ośrodków jako potencjalnych adresatów ankiety i źródeł materiału do badań. W celach instruktażowych opublikowano pracę przeglądową pt.: „Promieniowce chorobotwórcze i bakterie promieniowcopodobne: problemy taksono­miczne, diagnostyczne i kliniczne” H. Mordarska, B. Szponar, M. Paściak, A. Gamian, Mikrobiologia Medycyna, 2(19) 1999.

          Spośród nadesłanych materiałów klinicznych opartych na ankietach od 14 pa­cjentów, połowa została poddana bardziej szczegółowym badaniom. Z wyhodowanych mikroorganizmów przygotowano masę komórkową, określono profil kwasów tłusz­czowych, kwasów mikolowych, fosfolipidów, cukrów, aminokwasów, składników ściany komórkowej. Analizy te pozwoliły na identyfikację izolatów klinicznych.

          Badania powyższe pozwalają wnioskować, że dokładna ocena materiału klinicznego zazwyczaj daje odmienne wyniki od uzyskanych w rutynowych labora­toriach diagnostycznych. Często jednak otrzymany materiał, jako nietypowy, nie był wstępnie diagnozowany. Śledzenie tych rozbieżności, poszerzenie metod analizy, zbadanie większej liczby próbek pozwolą opracować właściwą strategię postępowania diagnostycznego. Otrzymane próbki stanowią cenny materiał badawczy, którego ocena jest przedmiotem przygotowanej publikacji. Badania mają charakter poznawczy i aplikacyjny.

Wykonawcy: dr M. Paściak, dr B. Szponar, mgr A. Grzegorzewicz,
prof. dr H. Mordarska

Publikacja  nr 93

Temat nr 47

Interferony w przebiegu zakażenia wirusami HIV i HCV

Laboratorium Wirusologii, p.o. kierownika: prof. dr hab. Zofia Błach-Olszewska

          Badania wykonane w 1998 r. (wyniki opublikowane w 1999 r.) wskazują, że poprawa stanu klinicznego pacjentów z AIDS w wyniku stosowania złożonej terapii antyretrowirusowej jest związana ze spadkiem podwyższonego w wyniku choroby poziomu IFN w surowicy. Efekt ten nie występował gdy leczenie było nieskuteczne. Interferon występujący w osoczu/surowicy pacjentów z AIDS został zidentyfikowany jako kwasolabilny interferon alfa.

          W 1999 r. oznaczono poziom IFN w 236 surowicach pochodzących od 74 pa­cjentów HIV/AIDS z Kliniki Chorób Zakaźnych AM we Wrocławiu. Pacjenci ci byli w różnym stanie klinicznym, w większości przypadków byli w trakcie wielolekowej terapii antyretrowirusowej, nie byli leczeni interferonem. Mimo, że wielu pacjentów było w złym stanie klinicznym (AIDS), z niską liczbą limfocytów CD4⁺, to tylko w 23% badanych surowic stwierdzono wysokie poziomy IFN (>20 jedn./ml). Jest to prawdopodobnie wynik powszechnego stosowania złożonej antyretrowirusowej terapii.

          Interferon występujący w badanych surowicach został scharakteryzowany przy użyciu antyinterferonowych surowic neutralizujących. Zbadana została także wraż­liwość preparatów na zakwaszanie do pH 2. Oznaczenia takie wykonano dla 36 su­rowic o mianie IFN >30 jedn./ml. Aktywność interferonowa była wrażliwa na działanie surowicy anty-IFN-a, niewrażliwa na surowicę anty-IFN-g oraz w dużym stopniu (ale nie całkowicie) wrażliwa na zakwaszenie do pH 2. Oznacza to, że IFN wykrywany w surowicach chorych na AIDS jest interferonem alfa, w większości kwasolabilnym. Taki wynik jest zgodny w wcześniejszymi doniesieniami z piśmien­nictwa i własnymi badaniami.

          Wykazanie statystycznie istotnej zależności między poziomem IFN w osoczu/surowicy a stanem klinicznym pacjentów HIV/AIDS oraz skutecznością stosowanej terapii było pierwszym etapem badań. Dysponując 341 oznaczeniami aktywności IFN wykonanymi w 1998 r. (78 surowic) i 1999 r. (236 surowic) u 83 pa­cjentów, zestawiono wyniki dla 41 chorych, u których poziom IFN był badany co najmniej trzy razy. Stwierdzono, że przerwa lub zaniechanie terapii antyretro­wirusowej odbijająca się niekorzystnie na kondycji pacjentów, powoduje również wzrost poziomu IFN w surowicy. Poziom IFN w osoczu/surowicy obrazuje prawdo­podobnie inne patologiczne zjawisko niż odzwierciedla to liczba limfocytów CD4⁺ lub wielkość wiremii, a więc wprowadzenie oznaczeń IFN do monitorowania pacjentów HIV⁺ wzbogaciłoby diagnostykę.

Wykonawcy: dr E. Piasecki

Publikacja nr 52

Temat nr 48

Biologiczna aktywność nowych heterocyklicznych związków selenu i azotu

Laboratorium Wirusologii, p.o. kierownika: prof. dr hab. Zofia Błach-Olszewska

          Przedmiotem badań były związki selenoorganiczne, pochodne ebselenu, oraz podobne strukturalnie związki nie zawierające selenu. Synteza tych związków była przeprowadzona w Instytucie Chemii Organicznej, Biochemii i Biotechnologii Politechniki Wrocławskiej przez zespół prof. J. Młochowskiego. W ubiegłych latach stwierdzono, że ebselen i niektóre jego nowe pochodne są induktorami cytokin, w tym IFN-g i TNF. Wykonane wstępne doświadczenia wskazywały, że niektóre związki selenoorganiczne mogą mieć ponadto bezpośrednie właściwości przeciwwirusowe.

          Badania przeprowadzone w 1999 r. obejmowały 4 grupy związków:

1.     Grupa A: N-podstawione benzisoselenazolony: AE-6 (ebselen), AE-133, AE-134, AE-146-AE-157;

2.     Grupa B. Selenosulfonamidy: AE-135, AE-143-AE-145, AE-160-AE-164;

3.     Grupa C. Diselenki bisarylowe: AE-171, AE-172;

4.     Grupa D. Proste sulfonamidy: AE-165-AE-170.

          Cytotoksyczność badanych związków określono na liniach komórkowych: ludzkiej A549 i mysiej L929. Najbardziej toksyczne okazały się związki z grupy A, zaś najmniejszą toksyczność miały sulfonamidy z grupy D.

          Zdolność do indukcji cytokin przez związki selenoorganiczne określono dodając badane preparaty do hodowli izolowanych leukocytów krwi zdrowych ludzi. W supernatantach oznaczano aktywność IFN, TNF i IL-10. Nie stwierdzono istotnego podwyższenia poziomu produkowanego IFN w porównaniu z kontrolą. Zwiększoną produkcję TNF wywoływała stymulacja leukocytów związkami z grupy A (AE-146, AE-147, AE-151 i AE-152), grupy B (AE-161, AE-162 i AE-164) oraz grupy D (AE-165 i AE-169). Poziomy wyprodukowanego TNF były niższe niż w przypadku użycia PHA. W przypadku IL-10 tylko PHA i związek AE-152 powodowały statystycznie istotne podwyższenie produkcji cytokiny. Żaden z badanych w bieżącym roku związków nie okazał się dobrym induktorem cytokin.

          Określono aktywność przeciwwirusową 27 związków. Badano bezpośrednie oddziaływanie związków na trzy wirusy: EMCV, HSV-1 i VSV. Stwierdzono, że związki AE-6, AE-133, AE-143, AE-146, AE-149, AE-150, AE-153, AE-154, AE-155, AE-156, AE-163 i AE-172 mają aktywność anty-HSV-1. Te związki oraz AE-135 działały również przeciwko wirusowi EMCV. Aktywność anty-VSV wykazywały AE-6 i AE-172.

          Analiza wyników nie wykazała korelacji między działaniem związków seleno­organicznych jako induktory cytokin i jako substancje przeciwwirusowe.

Wykonawcy: dr E. Piasecki, mgr K. Rybka

Temat nr 49

Zakażenia grzybicze, wirusowe i bakteryjne dróg oddechowych zaburzające objawy astmy oskrzelowej; wpływ terapii przeciwgrzybiczej na wydzielanie TNF-a, IL-6, IFN-g i IFN-a przez leukocyty oskrzelowo-pęcherzykowe

Laboratorium Wirusologii, p.o. kierownika: prof. dr hab. Zofia Błach-Olszewska

          W ubiegłych latach wykazaliśmy, że zakażenia grzybicze dróg oddechowych wywiązujące się w trakcie leczenia sterydami i antybiotykami i powodujące zaostrze­nie objawów w astmie oskrzelowej, wywołują nadmierną reaktywność komórek izolo­wanych z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych (BAL), wyrażającą się wzmożoną produkcją cytokin w odpowiedzi na działanie wirusa NDV lub produktu bakteryjnego jakim jest LPS. Sugeruje się, że komponenty ścian komórkowych grzybów lub ich formy przetrwalnikowe mogą preaktywować leukocyty powodując ich wzmożoną wrażliwość na induktory cytokin. Z kolei, wydzielane cytokiny mogą wzmagać procesy zapalne w drogach oddechowych astmatyków.

          W ramach realizacji planu na rok 1999 kontynuowano badania podjęte w ubiegłych latach. W Klinice Chorób Wewnętrznych i Alergologii AM we Wrocławiu badano dziesięciu leczonych prednisonem chorych na astmę oskrzelową zaburzoną infekcjami grzybiczymi, u których stwierdzono Aspergillus fumigatus i Candida albicans w drogach oddechowych. Płukanie dróg oskrzelowych prowadzono tylko w przypadkach zgodnych z wytycznymi ustalonymi przez Grupę Roboczą do Spraw Płukania Oskrzeli w Astmie Oskrzelowej przy Europejskim Towarzystwie Oddecho­wym (ERS) i za zgodą Komisji Etyki Badań Naukowych AM we Wrocławiu.

          Wykazano, że kliniczne implikacje związane z zaostrzonymi objawami astmy oskrzelowej mogą być uwarunkowane wysoką produkcją TNF-a i IL-6 w odpowiedzi na LPS, oraz nadmiernym wydzielaniem IFN-a po stymulacji komórek wirusem NDV. Przeciwgrzybicze leczenie spowodowało znaczne obniżenie wytwarzania TNF-a, IL-6 oraz IFN-a w porównaniu z sekrecją cytokin przed leczeniem. Eliminacja grzybów z dróg oddechowych spowodowała także poprawę stanu chorych, w tym parametrów spirometrycznych: natężonej pojemności wydechowej (FEV) oraz życiowej pojemności wydechowej (FVC). Poszukując zależności między różnicą w poziomie wydzielanych cytokin obserwowaną po leczeniu przeciwgrzybiczym a stanem klinicznym pacjentów stwierdzono dodatnią korelację między poziomem IL-6 a poprawą stanu chorych i natężoną pojemnością wydechową (FEV1) oraz ujemną korelację między poziomem IFN-a a oznaczanymi parametrami klinicznymi.

          Uzyskane wyniki sugerują, że za podwyższoną reaktywność leukocytów BAL mogą być odpowiedzialne grzyby obecne w drogach oddechowych badanych astma­tyków. W oparciu o przeprowadzoną analizę statystyczną można stwierdzić, że IFN-a wydaje się być jednym z czynników wzmagających bezpośrednio objawy astmy oskrzelowej. Może to mieć szczególne znaczenie w przypadkach, gdzie astma oskrzelowa zaburzona jest nie tylko zakażeniami grzybiczymi ale i nakładającymi się zakażeniami wirusami z grupy ortomyksowirusów, które znane są jako potencjalne induktory IFN-a. Ponadto, uzyskane wyniki dostarczają argumentów przeciwko próbom stosowania w immunoterapii alergii i astmy oskrzelowej IFN-a jako czynnika hamującego IL-4.

          Przypadki astmy oskrzelowej zaburzonej infekcjami grzybiczymi mimo, że są bardzo trudne do leczenia, nie są zbyt częste. Badania prowadzone na trudno osiągalnych komórkach, izolowanych z miejsc toczących się zmian zapalnych, wnoszą wkład w wyjaśnianie lokalnych mechanizmów zapalenia w astmie oskrzelowej i mogą stanowić podstawę do dalszych poszukiwań skutecznej terapii szczególnie w przypadkach stwarzających poważne problemy kliniczne i terapeutyczne.

Wykonawcy: dr M. Cembrzyńska-Nowak, mgr inż M. Bieńkowska
we współpracy z doc. drem med. J. Liebhartem, dr E. Liebhart i lek. med. R. Dobkiem z Kliniki Chorób Wewnętrznych i Alergologii AM we Wrocławiu

Temat nr 50

Wpływ pochodnych amidu kwasu 5-benzoiloamino 4-izotiazolokarboksylowego na wrodzoną, niespecyficzną przeciwwirusową aktywność leukocytów ludzkiej krwi obwodowej

Laboratorium Wirusologii, p.o. kierownika: prof. dr hab. Zofia Błach-Olszewska

          Wobec stwierdzonej wcześniej przeciwwirusowej i immunosupresyjnej aktyw­ności niektórych pochodnych amidu kwasu 5-benzoiloamino 4-izotiazolokarboksy­lowego, syntetyzowanych w Zakładzie Chemii Organicznej, Wydziału Farmacji AM, kierowanego przez prof. Z. Machonia, interesujące było zbadanie trzech nowych pochodnych: M-1/98, M/2/98 i M-3/98. Do doświadczeń, zamiast projektowanych ludzkich leukocytów krwi obwodowej, użyto mysich rezydujących komórek otrzew­nowych. Zmiana ta powodowana była planowanymi doświadczeniami in vivo.

          Doświadczenia obejmowały:

·     określenie toksyczności badanych związków dla linii komórkowych A₅₄₉ i L_929,

·     wrażliwość rezydujących komórek otrzewnowych (RKO) na zakażenie wirusem opryszczki (HSV-1),

·     wpływ badanych związków na replikację HSV-1 w komórkach otrzewnowych i na wrodzoną odporność tych komórek,

·     wpływ związków na produkcję niektórych cytokin przez RKO.

          Wykazano, że:

1)  związki M-2/98 i M-3/98 tylko w wysokich koncentracjach były toksyczne dla badanych linii komórkowych,

2)  komórki otrzewnowe tuż po izolacji były niewrażliwe na zakażenie HSV-1; kilkudniowe hodowanie RKO prowadziło do wzrostu ich wrażliwości na wirusa,

3)  stopień odporności komórek na zakażenie był zróżnicowany u indywidualnych zwierząt,

4)  związki M-2/98 i M-3/98 stymulowały replikację HSV-1 w RKO, co sugeruje ich prawdopodobną immunosupresyjną aktywność,

5)  wszystkie związki stymulowały w RKO wytwarzanie TNF-a i nie indukowały IFN-b. Wytworzenie TNF-a nie było zależne od stężenia związków.

Wobec zróżnicowanej osobniczej odporności RKO, badania wymagają powtórzenia i rozszerzenia na doświadczenia in vivo.

               Wyniki badań były prezentowane na ISCIR Meeting w Paryżu ( International Society for Interferon & Cytokine Research), abstrakt opublikowano w J. IFN Cytokine Res., 1999, 19, suppl. 1, 111.

Wykonawcy: dr E. Zaczyńska, mgr B. Orzechowska, mgr B. Domaraczenko

Publikacja nr 9

Temat nr 51

Badania nad wyjaśnieniem zróżnicowania antygenów serotypu O48 Salmonella zawierających kwas sjalowy

Laboratorium Mikrobiologii Lekarskiej, kierownik: doc. dr hab. Andrzej Gamian

          Obecność kwasu sjalowego w antygenach otoczkowych niektórych bakterii jest sprzężona z ich zwiększoną patogennością. W przypadku lipopolisacharydów, udział kwasu sjalowego w patogenności dotychczas przypisywano endotoksynom Neisseria meningitidis i Campylobacter jejuni, które są zdolne do indukcji autoprzeciwciał u gospodarza. Aktywność biologiczna badanych przez nas struktur nadal pozostaje nieznana. Interesującym modelem dla takich badań jest chemotyp Y rodzaju Salmonella i struktury pokrewne posiadające kwas sjalowy, przedmiot obecnych badań.

          W wyniku przeprowadzonych doświadczeń z zastosowaniem analizy cukrowej, metylacyjnej i spektroskopii NMR, ustalono budowę biologicznej powtarzającej się jednostki polisacharydu O-swoistego S. toucra O48 i Citrobacter freundii O37.

S. toucra O48                 ®4)-a-NeupNAc(2®3)-L-a-FucpNAc(1®3)-D-b-GlcpNAc(1®

C. freundii O37              ®7)-a-NeupNAc(2®3)-L-a-FucpNAc(1®3)-D-b-GlcpNAc(1®

          Grupy O-acetylowe w polisacharydzie S. toucra O48 rozmieszczone są w po­zycjach O-9 i O-7 NeuNAc w proporcji 10:1. Podjednostka O-swoista C. freundii O37 posiada identyczny skład cukrowy i różni się tylko podstawieniem kwasu sjalowego i lokalizacją grupy O-acetylowej, która znajduje się w pozycji O-6 reszty glu­kozaminowej. Te różnice są przyczyną braku reaktywności krzyżowej między powyższymi antygenami.

          Analiza porównawcza O-antygenów kilkunastu serowarów serotypu O48 Salmonella za pomocą SDS-PAGE i immunoblotingu z surowicą anty-S. toucra O48 wykazała heterogenność polisacharydów O-swoistych.

          Wyniki powyższych badań pozwalają na identyfikację epitopów zawierających kwas sjalowy i stwarzają możliwość badań udziału kwasu sjalowego w procesach odpornościowych i zakażeniach.

Wykonawcy: dr D. Witkowska, mgr A. Korzeniowska-Kowal, mgr J. Rybka,
mgr M. Staniszewska

Temat nr 52

Analiza właściwości biologicznych antygenu śluzowego Pseudomonas aeruginosa

Laboratorium Mikrobiologii Lekarskiej, kierownik: doc. dr hab. Andrzej Gamian

          Pseudomonas aeruginosa wywołuje u ludzi zakażenia ran, oparzeń, dróg moczowych i oddechowych, opon mózgowo-rdzeniowych, kości, szpiku, stawów, a także zapalenia oka i ucha. Często powoduje chroniczne zakażenia płuc u chorych na mukowiscydozę. Choroby te stanowią wciąż poważny problem medyczny. Nasze uprzednie badania dotyczyły izolatu klinicznego, który wytwarza śluz typu algino­wego. Wyizolowany i oczyszczony polisacharyd śluzowy poddano frakcjonowaniu uzyskując materiał nisko i wysoko cząsteczkowy. Wykazano, że poszczególne frakcje polisacharydu nie są cytotoksyczne, nie są istotnymi induktorami TNF, IL-6, natomiast materiał niskocząsteczkowy stymulował produkcję IFN.

          Wyniki badań przeprowadzone testem z użyciem ludzkiej pełnej krwi obwo­dowej wykazały, że podobnie jak w przypadku IFN, frakcja niskocząsteczkowa polisacharydu śluzowego była lepszym induktorem IL-2 niż frakcja wysoko­cząsteczkowa. Natomiast wytwarzanie IL-10 było silniej stymulowane przez materiał wysokoczasteczkowy. Nie stwierdzono różnic w stymulacji wytwarzania produktów NO między frakcjami polisacharydowymi. Badane frakcje nie wykazywały aktywności indukującej apoptozę komórek A₅₄₉ w teście elektroforetycznym. Wyniki powyższe sugerują, że alginian niskocząsteczkowy P. aeruginosa może stymulować inną subpopulację komórek układu odpornościowego niż wysokocząsteczkowy. Alginian P. aeruginosa nie jest silnym induktorem mediatorów komórkowych. Korzystne właściwości odpowiednich frakcji alginianu P. aeruginosa mogą znaleźć praktyczne zastosowanie, w tym mogą być wykorzystane do wytworzenia skutecznej i bezpiecznej szczepionki.

Wykonawcy: dr A. Czarny, mgr M. Kocięba, mgr T. Lipiński, dr M. Mieszała

Temat nr 53

Badania strukturalne i serologiczne antygenów powierzchniowych pałeczek Gram-ujemnych. Struktura polisacharydów O-swoistych 481-L 1196 Hafnia alvei oraz analiza serologiczna szczepów Citrobacter freundii

Laboratorium Mikrobiologii Lekarskiej, kierownik: doc. dr hab. Andrzej Gamian

          Znajomość struktur powierzchniowych drobnoustrojów patogennych jest ważna dla zrozumienia oporności antybiotykowej i procesów translokacji bakterii, będących przyczyną uogólnionych zakażeń i wstrząsu septycznego. Dotyczy to szeregu rodzajów bakterii jelitowych z rodziny Enterobacteriaceae, dla których określenie antygenowości i ustalenie epitopów jest punktem wyjścia do badań powyż­szych procesów. W ramach tego tematu ustalono budowę antygenu O-swoistego Citrobacter freundii O9a,9b, który zawiera polimer N-acetylo-D-perozaminy, podobny do antygenu Vibrio cholerae O1, [®2)-a-D-Rha4NAc-(1®], oraz polisacharyd o następującej budowie:

®3)-a-DRha4NAc(1®2)-a-DRha4NAc(1®2)-a-DRha4NAc(1®3)-a-DRha4NAc2Ac(1®

          Analiza widm masowych MALDI wskazuje, że oba polisacharydy nie stanowią odrębnych polimerów, lecz związane są w jednej makrocząsteczce. Nie stwierdzono reaktywności krzyżowej między antygenami C. freundii O9a,9b a V. cholerae O1, najprawdopodobniej ze względu na różne podstawniki N-acylowe.

          Ustalono również, że opisany wcześniej w naszym Instytucie antygen C. freundii PCM 1487 (Eur. J. Biochem. 1985, 146, 641-647) stanowi serotyp C. freundii O5a,5b,4b.

          Określono wstępną budowę antygenu O-swoistego Hafnia alvei szczep 481-L, stanowiącego odrębny serotyp tego gatunku bakterii. Heksasacharydowe podjednostki połączone są ze sobą w polimerze wiązaniami fosfodwuestrowymi.

Wykonawcy: dr J. Kübler-Kiełb, mgr M. Wawrzynowicz, dr M. Łusiak

Temat nr 54

Badania nad biologią bakteriofagów i ich wykorzystaniem w leczeniu zakażeń bakteryjnych – badania reaktywności komórek krwi obwodowej pacjentów poddanych fagoterapii

Laboratorium Bakteriofagowe

          Pierwsze nasze badania nad wpływem fagoterapii na stan immunologiczny pacjentów ujawniły zależność między efektywną fagoterapią a normalizacją produkcji cytokin przez komórki krwi obwodowej. Obecne badania miały na celu znalezienie zależności między efektywnością fagoterapii a innymi parametrami, takimi jak: obraz krwi obwodowej, zdolność neutrofilów do fagocytozy Staphylococcus aureus, odsetek komórek noszących receptory dla trzeciej składowej komplementu oraz poziom laktoferyny (LF) w krążeniu. Wyniki badań ujawniły spadek ogólnej liczby leukocytów, neutrofilów i limfocytów. Wzrósł jednakże bardzo znacznie odsetek prekursorowych form neutrofilów (3,5-krotnie). Obserwowano także spadek odsetka komórek two­rzących rozety EAC (o 32%) oraz zdolności do fagocytozy (o 22%). Jednakże u pacjentów wykazujących początkowo niższe poziomy rozet EAC i komórek fago­cytujących te zmiany były nieznaczne. Wykazano także regulacyjny wpływ terapii na poziom laktoferyny w krążeniu, w tym znaczny bo 3-4-krotny wzrost LF w kategoriach pacjentów o początkowym, niskim jej poziomie.

          Uzyskane wyniki wskazują na różnice w wielkości badanych parametrów immunologicznych między osobnikami zdrowymi (12), a pacjentami (13). W obrazie krwi najbardziej charakterystyczną zmianą jest znaczny wzrost odsetka form młodo­cianych neutrofilów, co może wskazywać na działanie produktów bakteryjnych pochodzących z preparatu (lizatu) fagowego na układ immunologiczny pacjentów. Być może jest to element wspomagający działanie fagów. Inne zmiany dotyczą spadku zdolności do fagocytozy i odsetka komórek zwierających receptory dla trzeciej składowej komplementu. Zmiany te mogą odzwierciedlać powrót do stanu równowagi po efektywnej fagoterapii. Wzrost poziomu LF w krążeniu wskazuje na stymulujący wpływ preparatu fagowego na degranulację neutrofilów (źródło LF) i wzmożony obrót tych komórek. Na zwiększony wyrzut neutrofilów ze szpiku wskazuje także znacznie podwyższony poziom form młodocianych tych komórek. Podwyższony poziom LF, białka o pośrednich i bezpośrednich właściwościach bakteriobójczych oraz wzmożona produkcja neutrofilów – głównych fagocytów krwi obwodowej, może tłumaczyć efektywność terapii fagowej. Do chwili obecnej przebadano w sposób kompletny 13 pacjentów. Uzyskane wyniki należy traktować jako wstępne. Kontynuowanie badań i ich przeprowadzanie u większej liczby pacjentów pozwoli na pełniejsze określenie wpływu fagoterapii na ich układ immunologiczny.

Wykonawcy: dr B. Weber-Dąbrowska, prof. M. Mulczyk przy współpracy
z prof. drem M. Zimeckim – Laboratorium Immunobiologii IITD

Zakład Immunologii Nowotworów

Temat nr 55

Utrzymanie kolekcji myszy szczepów wsobnych, transgenicznych, z knock-out’em genu dla IL-6 i myszy bezgrasiczych nu/nu, jak również zbioru ludzkich i zwie­rzęcych linii komórek nowotworowych, w tym zmodyfikowanych manipulacją genetyczną – II etap realizacji

Kierownik zespołu badawczego: prof. dr Czesław Radzikowski

          Realizując temat przygotowano plan reorganizacji zwierzętarni i wykonano adaptację pomieszczeń na okres przejściowy do zmywania i sterylizacji materiału do obsługi Zwierzyńca Doświadczalnego. Z Amerykańskiej Kolekcji Linii Komórkowych sprowadzono niezbędne linie komórkowe do uzupełnienia Banku Linii Komórkowych IITD PAN. W ramach realizacji tematu zakupiono w Centrum Onkologii w Warszawie zwierzęta do doświadczeń. Przygotowano plan przystosowania pomieszczeń przezna­czonych na Zwierzyniec Doświadczalny, odpowiadający standardom określonym przez Krajową Komisję Etyczną w oparciu o Ustawę o Ochronie Zwierząt dostoso­waną do norm europejskich.